HPLC法测定芪月降脂片中两种泽泻醇的含量

姜南辉

芪月降脂片是利用现代中药有效成分提取法提取泽泻、黄芪、月见草油等中药中的有效部位，再采用现代药物制剂技术将其制成制剂的纯中药降脂新药［1］。药效学研究表明，芪月降脂片明显降低高脂血症大鼠血清胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量，提高高密度脂蛋白的含量，同时降低肝脏中甘油三酯以及丙二醛含量［2］。泽泻的主要成分为原萜烷型四环三帖类化合物即泽泻醇类化合物［3，4］，其中泽泻醇 A-24-乙酸酯、泽泻醇B-23-乙酸酯为其利尿、降血脂等作用的主要有效成分［5］。本实验以泽泻醇 A-24-乙酸酯、泽泻醇B-23-乙酸酯作为芪月降脂片质量控制的主要指标，建立了HPLC含量测定方法，为芪月降脂片的质量评价提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent-1100型高效液相色谱仪;G1314A紫外检测器，N2000色谱工作站;CP225D型电子天平;泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯对照品均由本实验室自制，采用HPLC峰面积归一化法测定，其纯度均大于98%;芪月降脂片为自制，批号为121106、121118、121130;乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Accurasil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈-水(78∶22);检测波长208 nm;流速为0.8 ml/min;柱温为室温;进样量10 μl。

在此色谱条件下，泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯均具有良好的分离度，且与其邻峰的分离度均大于1.5，基线噪音小。见图1。

A.对照品;B.样品;1.泽泻醇A-24-乙酸酯;2.泽泻醇B-23-乙酸酯图1 对照品(A)及样品(B)HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备 精密称取泽泻醇A-24-乙酸酯、泽泻醇B-23-乙酸酯对照品适量，加乙腈溶解，制成含泽泻醇 A-24-乙酸酯、泽泻醇 B-23-乙酸酯分别为152.6，166.8 μg/ml的对照品混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取芪月降脂片10片，研细，精密称取0.50 g，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入乙腈100 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，用乙腈补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.2”项下对照品溶液 5，10，15，20，25 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积。以色谱峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归，绘制标准曲线。泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的回归方程分别为:

Y=11.09 X+2.697，r=0.9998

Y=15.66 X+9.087，r=0.9996

结果表明，泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯分别在0.763～3.815 μg和0.834 ～4.170 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取同一对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，每针进样10 μl，泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇 B-23-乙酸酯峰面积的 RSD分别为1.55%、0.97%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取同一批样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，计算泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的平均含量分别为0.26%、0.43%;RSD分别为0.97%、1.65%。表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h测定。泽泻醇 A-24-乙酸酯和泽泻醇 B-23-乙酸酯峰面积的RSD分别为1.15%、1.85%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的芪月降脂片细粉6份，每份约0.25 g。分别准确加入泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的对照品溶液适量，按“2.3供试品溶液的制备”项下方法进行制备，即得供试液。在上述色谱条件下测定，记录色谱峰面积。泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的平均回收率分别为99.72%、99.53%;RSD分别为 0.50%、0.72%。表明方法的准确度良好。见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9 含量测定 取3个不同批号的芪月降脂片(121106、121118、121130)，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件，制备供试品溶液并注入液相色谱仪进行测定。计算泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的含量。见表2。

表2 泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯含量

3 讨论

3.1 提取时间的选择 按“2.3供试品溶液的制备”项下操作，分别考察超声提取10、20、30、40、50 min 对药品测定结果的影响，结果表明提取时间30 min就可以达到基本提取完全。

3.2 检测波长的选择 泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯均为原萜烷型四环三萜类化合物，表现为紫外末端吸收，且在208 nm处有最大吸收峰。虽为紫外末端吸收，但其响应较好，因此采用吸收波长208 nm作为检测波长。

3.3 流动相的选择 泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯化学结构十分接近，试验用过乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈-水等不同的流动相体系，结果发现乙腈-水流动相系统可较好地满足实验需求，经反复试验，当乙腈-水的比例为78∶22时，色谱图有较好的分离度、峰形。

芪月降脂片中化学成分众多，其中泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯含量都比较大，且性质稳定，可用于定性、定量研究。本实验首次建立了采用HPLC方法同时测定芪月降脂片中泽泻醇A-24-乙酸酯和泽泻醇B-23-乙酸酯的含量。该方法操作简单，具有分离效果好、灵敏度高、准确性好、操作简单等优点，可以用于芪月降脂片的质量控制。

1 张善玉，金在久，康东周，等.高效液相色谱法测定芪月降脂片中金丝桃苷的含量.延边大学医学学报，2004，27:177-179.

2 申英爱，张善玉，金在久.芪月降脂片对小鼠的急性毒性反应实验研究.延边大学医学学报，2004，27:29-30.

3 罗张炎，周爱存，张朝凤，等.HPLC同时测定泽泻中4种泽泻醇成分的含.中国中药杂志，2010，35:3306-3309.

4 易醒，黄丹菲，肖小年，等.泽泻的研究现状与展望.时珍国医国药，2007，18:331-333.

5 陆霄鹤.HPLC法测定生泽泻、盐泽泻中24-乙酰泽泻醇A的含量.内蒙古中医药，2013，32:43.