房颤患者miR-208及IL-18的表达及相关性研究

陈恩平 邱健 杜丽根

心房颤动(房颤)严重威胁人类的健康和生命，其发病率、致残率高、危害大。目前其病理生理学机制尚未完全明确。目前miRNA与心脏的相关性成为研究的热点之一［1，2］。新发现的 miRNA-208具有心肌表达特异性，在调节的心肌生长中起重要作用，与心肌纤维化密切相关［3，4］。IL-18 在炎性反应中起重要作用［5，6］。本文研究通过观察房颤患者miR-208及炎性因子IL-18的变化，分析miRNA-208与IL-18及房颤相关性，探讨房颤的发生机制，这对于房颤未来的诊疗策略提供理论和实验依据，提供新思路有重要临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年8月至2014年8月龙岗区第二人民医院住院的房颤患者99例(房颤组)，男49例，平均年龄(56.5±5.6)岁;同期体检中心体检健康志愿者29例(对照组)，男15例，平均年龄(57.26±5.92)岁。按照2006年《美国心房颤动治疗指南》将房颤组分为阵发性房颤、持续性房颤及永久性房颤3个亚组。排除标准:房颤病史不明、恶性肿瘤、近期感染、结缔组织病、自身免疫病、帕金森综合征及严重肝、肾功能不全患者。所有研究对象均自愿参加并签署了知情同意书。

1.2 方法 (1)临床资料:完善所有研究对象心血管流行病学问卷及一般临床资料，包括性别、年龄、既往史、吸烟史等。所有研究对象心脏彩超检查由龙岗区第二人民医院超声科专人实施。(2)标本采集:入院首日采晨时空腹12 h以上肘静脉血，测定血脂、血糖等，并留取空腹血4 ml，按照美国MRC公司RNA提取试剂盒说明离心取血清，储存于-80℃冰箱中待测血清miRNA浓度及酶联免疫法检测IL-18水平。(3)实验室检测:应用罗氏全自动生化仪(瑞士)测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、肌酐(Cr)、hs-CRP、B 型利钠肽(BNP)。

1.3 血清miR-208表达水平检测 以U6为内参，采用染料法实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测(日本Takara公司反转录及荧光定量试剂盒;广州锐博公司特异性茎一环引物，上、下引物及U6;瑞士罗氏公司Light—CyclerSoftware 1.5荧光定量PCR仪)，所有样本的检测均采用同一批次试剂盒，并在同一台仪器及相同的条件下进行。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，对于偏态或方差不齐的多组样本间比较采用多个独立样本的秩和检验(日检验)。计数资料采用χ2检验，两两相关分析采用Pearson相关分析以及偏相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组临床一般资料及实验室指标比较 2组年龄、性别比、冠心病、糖尿病、高血压病和风湿性心脏病者的比例、吸烟史、TC、TG、HDL-C水平方面2组差异无统计学意义(P＞0.05);而患者年龄及左心房内径、左心室射血分数(LVEF)、IL-18水平方面，房颤组(除LVEF外)均高于对照组(P＜0.05)。在房颤患者的亚组分析中，年龄、左心房内径、LVEF水平方面差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 2组一般临床资料及实验室指标比较±s

表1 2组一般临床资料及实验室指标比较±s

注:与对照组比较，*P＜0.05;与阵发性房颤比较，#P＜0.05

项目 对照组(n=29)阵发性房颤组(n=32)持续性房颤组(n=31)永久性房颤组(n=36)男/女(例)15/14 15/17 15/16 19/17年龄(岁，±s)57.5±5.859.5±6.261.3±6.562.6±6.8冠心病［例(%)］ 0 5(15.6) 10(32.2)* 8(22.2)*糖尿病［例(%)］ 0 3(9.3) 6(19.3)* 2(5.5)*高血压［例(%)］ 0 18(56.3) 15(48.4)* 12(33.3)*风湿性心脏病［例(%)］ 0 4(12.5) 8(25.8)* 13(36.1)*吸烟史［例(%)］ 6(20.7) 15(46.9) 14(45.2) 10(27.8)左心房内径(mm，±s)41.5±3.444.5±4.2*50.2±3.8*#50.6±4.3*#LVEF(%，±s)56.5±4.545.2±5.1*47.0±6.5*48.0±6.8*收缩压(mm Hg，±s)132±15135±13138±14139±13舒张压(mm Hg，±s)68±775±668±867±8 TC(mmol/L) 1.63±0.87 2.03±0.82 2.63±1.07 2.82±1.12 TG(mmol/L) 4.05±1.30 3.97±1.20 4.56±1.28 4.82±1.26 LDL-C(mmol/L) 3.29±0.90 3.29±0.80 4.43±1.16 5.06±0.88 HDL-C(mmol/L) 2.15±0.32 1.15±0.33 1.13±035 1.05±0.26血肌酐(μmol/L) 72.3±9.8 75.4±10.2 76.8±6.5 80.2±8.1 IL-18(pg/L) 71±14 99±16 115±20*# 146±23*#

2.2 实时荧光定量PCR相对定量检测miR结果 采用2-△△Ct相对定量法，以对照组miR表达水平为1，房颤组miR-208表达水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。亚组分析中，阵发性房颤、持续性房颤及永久性房颤之间miR-328的表达水平差异有统计学意义(P＜0.05)，且随房颤持续时间的延长而表达增加。见表2。

表2 2组miR-208检测结果比较±s

表2 2组miR-208检测结果比较±s

注:P值1:为对照组与房颤组之间比较;P值2:为房颤亚组之间的比较;△△Ct=［(房颤组miR-208 Ct值一房颤组内参ct值)一(对照组miR-208 Ct值一对照组内参Ct值)］;2-△△Ct:miR-208的相对表达量(说明:Ct值代表每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，不能直接用来比较，经过2-△△Ct转化为相对表达量，即房颤组与对照组的倍数关系后比较，需要用相关软件进行统计，如REST统计软件)

项目 对照组(n=29) 房颤组(n=99)房颤亚组阵发性房颤(n=32)持续性房颤(n=31)永久性房颤(n=36)P 1 P2男/女(例)15/14 49/50 15/17 15/16 19/17 0.589 0.075 miR-208Ct值 37.56±0.85 32.52±1.02 33.25±0.96 32.56±1.05 31.32±1.12 MiR-208相对表达量(△Ct) -0.57±0.68 -1.62±1.02 -0.38±0.83 -1.68±0.54 -2.58±1.05-△△Ct 0 -2.25±1.05 0.65±0.32 -2.28±1，02 -3.25±1.12 2-△△Ct 1 7.52±1.23 2.02±9.05 6.32±2.35 12.58±3.58 0.000 0.000

2.3 相关性分析 (1)miR-328与其他指标的Pearson相关分析:房颤组miR-328与已知房颤危险因素如年龄、左心房内径等呈正相关关系，相关系数分别为0.369(P＜0.05)、0.364(P＜0.05);(2)偏相关分析:调整性别、年龄、冠心病、糖尿病、风湿性心脏瓣膜病、高血压及吸烟等因素后，房颤组中血浆miR-208表达水平仍与左心房内径呈正相关(r=0.332，P＜0.05)。见表3。

表3 房颤组miR-328与各指标相关分析

3 讨论

房颤发生的病理生理机制非常复杂，包括钙离子稳态失调、离子通道改变、心房电生理及结构重构、炎性反应等［7］。目前miRNA与心脏的相关研究成为研究的热点之一［8］。miRNA类内源性因子在房颤中的作用及机制尚未系统阐明。Lu等［9］通过microRNAs表达谱芯片筛查风湿性心脏病合并房颤及心房快速起搏致犬房颤模型，发现microRNA-223、microRNA-328、microRNA-664表达都较对照组增高2倍以上。而关于miR-208是否参与了房颤的发展，目前笔者未见报道。

MiR-208由肌球蛋白重链(α-MHC)的内含子编码，特异性地表达于心肌组织，其功能主要在心肌细胞发育过程中调控肌球蛋白重链的生成。最新研究显示，血清miR-208的表达水平与心肌损伤疾病有关，可能与心肌纤维化相关［10］。Ceylan-Isik 等［11，12］研究发现microRNA-208在心脏肥厚、心力衰竭中具有促纤维化作用，提示miR-208可能参与了房颤的发生发展。本研究发现，与对照组比较，房颤组miR-208明显高于对照组，miRNA208在永久性房颤组、持续性房颤组明显高于阵发性房颤，提示miR208随着房颤持续的时间而增加。提示miRNA-208与房颤密切相关。

近几年炎症在心房纤颤中的作用受到越来越多的关注。越来越多的研究表明:房颤与心脏或全身炎性反应有关，炎性反应在心房颤动的发生和维持中起重要作用。IL-18是一种新型白介素因子，是炎症敏感标志物，能够将T细胞和巨噬细胞激活，生成一系列细胞因子，促进炎性反应［13］。本研究发现，房颤组IL-18明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示炎性反应与房颤关系密切，参与了房颤的发生发展。机制可能是炎症过程中产生的IL-18等介质可特异性的与磷脂酰胆碱结合，磷脂酰胆碱可形成长链酰基卡尼丁和溶血磷脂酰胆碱，两者均可抑制肌质网钠钙交换，影响膜的功能，引起钙离子超载，心肌损伤，导致心肌间质纤维化以及电传导不均一，从而易于诱发心房内及心房间的传导阻滞或折返影响心肌细胞间电信号的传导。因此心房细胞及间质的炎性过程可直接引起膜电位的波动，导致心房颤动的发生与维持。

房颤的发病机制多而复杂，各发病机制之间可能相互关联，相互影响。早在1994年Framingham研究中就已发现心房增大导致房颤的发生，左心房大小是发生房颤的独立危险因素［14］。本研究房颤患者心房内径大于对照组，房颤组miR-328与左心房内径、IL-18等呈正相关关系，相关系数分别为r=0.3694(P＜0.05)，r=0.353(P＜0.05);偏相关分析:调整性别、年龄、冠心病、糖尿病、风湿性心脏瓣膜病、高血压及吸烟等因素后，房颤组中血浆miR-328表达水平仍与左心房内径、IL-18相关(r=0.332，P＜0.05)。提示房颤患者miR-208与心房大小及炎症可能存在一定的关联。机制可能为房颤导致心肌细胞内钙超载，引起心房肌细胞凋亡，在坏死、纤维化心肌细胞周围有明显的炎性反应细胞浸润，导致心房肌纤维化及心房扩大，心肌纤维化，导致miR-208水平升高，同时过氧化物介导的蛋白硝基化增加，进而通过折返机制使房颤得以维持。本研究样本量少，有待大量样本进一步研究证实。因此，通过检测房颤患者miR-208、IL-18水平可能有助于房颤的分类及风险评估，对miR-208及IL-18相关性的进一步研究能为房颤的诊疗提供新的思路。

1 Nie X，Su L，Zhou Y，et al.Association between plasma levels of microRNA-126 and coronary collaterals in patients with coronary artery disease.Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi，2014，42:561-565.

2 Hinkel R，Ng JK，Kupatt C.Targeting microRNAs for cardiovascular therapeutics in coronary artery disease.Curr Opin Cardiol，2014，29:586-594.

3 Prado-Uribe MD，Soto-Abraham MV，Mora-Villalpando CJ，et al.Role of thyroid hormones and mir-208 in myocardial remodeling in 5/6 nephrectomized rats.Arch Med Res，2013，44:616-622.

4 Zile MR，Mehurg SM，Arroyo JE，et al.Relationship between the temporal profile of plasma microRNA and left ventricular remodeling in patients after myocardial infarction.Circ Cardiovasc Genet，2011，4:614-619.

5 Matteini AM，Li J，Lange EM，et al.Novel gene variants predict serum levels of the cytokines IL-18 and IL-1ra in older adults.Cytokine，2014，65:10-16.

6 Roth W，Kumar V，Beer HD，et al.Keratin 1 maintains skin integrity and participates in an inflammatory network in skin through interleukin-18.J Cell Sci，2012，125:5269-5279.

7 Jiang MH，Su YM，Tang JZ，et al.Angiotensin-converting enzyme gene 2350 G/A polymorphism and susceptibility to atrial fibrillation in Han Chinese patients with essential hypertension.Clinics(Sao Paulo)，2013，68:1428-1432.

8 Zhao Y，Schetter AJ，Yang GB，et al.microRNA and inflammatory gene expression as prognostic marker for overall survival in esophageal squamous cell carcinoma.Int J Cancer，2013，132:2901-2909.

9 Lu Y，Zhang Y，Wang N，et al.MicroRNA-328 cibtrubytes to adverse E-lectrical remodeling In atrial fibrillation.Circulation，2010，122:2378-2387.

10 Luo X，Zhang H，Xiao J，et al.Regulation of human cardiac ion channel genes bymicro RNAs:theoretical perspective and pathophysiological implications.Cell Physiol Biochem，2010，25:571-586.

11 Ceylan-Isik AF，Kandadi MR，Xu X，et al.Apelin administration ameliorates high fat diet-induced cardiac hypertrophy and contractile dysfunction.J Mol Cell Cardiol，2013，63:4-13.

12 Prado-Uribe MD，Soto-Abraham MV，Mora-Villalpando CJ，et al.Role of thyroid hormones and mir-208 in myocardial remodeling in 5/6 nephrectomized rats.Arch Med Res，2013，44:616-622.

13 Wen D，Liu J，Du X，et al.Association of interleukin-18(-137G/C)polymorphism with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus:a meta-analysis.Int Rev Immunol，2014，33:34-44.

14 Vaziri SM，Larson MG，Benjamin EJ，et al.Echoeardiographic predictors of nonrheumatic atrial fibrillation.The Framingham Heart Study，Circulation，1994，89:724-730.