益生菌混合发酵酸豆乳的工艺条件优化*

郭颖，涂顺明，骆练，刘新征，郑芳燕

(中国食品发酵工业研究院，北京，100015)

目前市场上常见的益生菌酸乳是以牛乳为原料的酸牛乳，而以大豆为原料的益生菌发酵酸豆乳产品比较罕见。这主要是因为益生菌在豆乳中不易生长，豆乳中缺乏益生菌所能利用的乳糖，发酵后的产品酸度和菌数明显低于酸牛乳，另一重要原因是豆乳发酵后会产生一些不良风味和豆腥味，影响消费者的接受度［1］。本研究通过优化适合豆乳发酵的益生菌菌种和合理的工艺，较好地解决了上述问题。

益生菌酸豆乳通常是指大豆萃取液(豆乳)经益生菌发酵制成的一种外观颇似酸奶、具有独特豆香味的健康食品。本研究采用动/植物来源的菌种结合对豆乳进行发酵研究，其中优选的植物乳杆菌广泛存在于泡菜中，是一种安全无害的有益菌种。由于大豆和泡菜均属于植物性原料，因此具有一定的发酵相似性。实验证明，植物乳杆菌对豆乳发酵有其特点和优势［2］。将驯化后的动物性来源的菌种(嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌)和植物性来源的菌种(植物乳杆菌)进行混种发酵，并确定酸豆乳生产过程中的适宜发酵条件，开发出高品质的益生菌发酵酸豆乳产品，可为优质大豆酸乳产业化提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆、全脂乳粉、蔗糖，市售。

1.2 菌种

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，St)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus，Lb)、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum，Lp)，均由中国食品发酵工业研究院植物蛋白研究中心提供。

1.3 培养基

脱脂乳培养基［3］:配制12%的全脂复原乳，100℃，30 min煮沸，自然冷却。待出现脂肪层后，取下层乳液分装于试管1/3处，121℃，15 min灭菌，冷却，低温保藏。用于工作发酵剂的制备。

MC培养基:按 GB 4789.35—2010附录 A方法配制。用于嗜热链球菌的活化、母发酵剂的制备和平板计数。

MRS培养基:按 GB 4789.35—2010附录 A方法配制。用于保加利亚乳杆菌的活化、母发酵剂的制备和平板计数，以及乳酸菌菌落总数的平板计数。

CM0006 MRS培养基:酪蛋白胨 10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉 4.0 g，葡萄糖 20.0 g，MgSO40.2 g，乙酸钠 5.0 g，柠檬酸三铵 2.0 g，K2HPO42.0 g，MnSO20.05 g，吐温 80 1.0 g，蒸馏水 1 000 mL。pH(6.2 ±0.2)。固体培养基可添加 CaCO320.0 g，琼脂 15.0 g。用于植物乳杆菌的活化、母发酵剂的制备和平板计数。

1.4 仪器与设备

HDL洁净工作台，北京东联哈尔仪器公司;LDZX-30FB压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;SPX-150BⅢ生化培养箱，天津泰斯特仪器公司;PHS-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂;NDJ-8S数字式黏度计，上海尼润智能科技有限公司;九阳豆浆机，JYDZ，济南九阳电器有限公司。

1.5 工艺流程和简要说明

大豆经清洗后按豆水质量比1∶6磨浆，100目过滤，得到蛋白质含量为3%左右的豆乳，再经配料和均质，121℃，15 min灭菌，冷却接种，按设定温度发酵，4℃冷藏，12 h后制得益生菌酸豆乳。

1.6 方法

1.6.1 发酵用菌种的活化

将St、Lb和Lp分别接种于 MC、MRS和 CM0006 MRS培养基中，37℃恒温培养48 h，活化2～3代备用。

1.6.2 母发酵剂和工作发酵剂的制备

将充分活化后的St、Lb和Lp于固体斜面培养基上分别转接于MC、MRS和CM0006 MRS液体培养基中，37℃摇床培养48 h，制作成母发酵剂。

将母发酵剂按照3%的接种量接种于脱脂乳培养基中，3种菌分别于43、43、37℃恒温培养48 h，制作成工作发酵剂。

1.6.3 发酵用菌种的驯化

豆乳与牛乳成分上的主要区别在于豆乳中不含乳糖，致使益生菌在豆乳中不能很好地生长繁殖。将St、Lb和Lp工作发酵剂按5%的接种量分别接种于12%的全脂复原乳(蛋白质3%)中，在43、43、37℃的条件下恒温培养，待培养液凝固后再传至下一代。在此过程中，逐步用3%蛋白含量的豆乳代替牛乳，并逐渐增加豆乳量，如此继代培养，直至益生菌可以适应100%纯豆乳的生长环境［4］。

1.6.4 优化酸豆乳发酵条件的单因素实验设计

1.6.4.1 St、Lb 和 Lp 混种发酵菌种配比对发酵豆乳的影响

在前期试验的基础上，确定了St和Lb的比例为1∶1为宜，因此，如何将Lp按照适当的比例与另外两种菌混合发酵是本次试验的重点。

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分装灭菌后冷却到40℃，将St、Lb和Lp按照4∶4∶1、2∶2∶1、1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶4的比例接种，接种量为5%，40℃恒温发酵5 h，之后4℃冷藏，后熟12 h，测定酸度。

1.6.4.2 接种量对发酵豆乳的影响

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分装灭菌后冷却到40℃，将St、Lb和Lp按照1∶1∶1的比例接种，接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%，40℃恒温发酵5 h，之后4℃冷藏，后熟12 h，测定酸度。

1.6.4.3 发酵温度对发酵豆乳的影响

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分装灭菌后分别冷却到31、34、37、40和43℃，将 St、Lb和Lp按照1∶1∶1的比例接种，接种量为5%，按以上温度恒温发酵5 h，之后4℃冷藏，后熟12 h，测定酸度。

1.6.4.4 发酵时间对发酵豆乳的影响

取100 mL豆乳(3%蛋白)，添加一定量的蔗糖，分装灭菌后分别冷却到40℃，将St、Lb和Lp按照1∶1∶1的比例接种，接种量为5%，40℃恒温发酵3、4、5、6、7、8 h，之后 4 ℃冷藏，后熟 12 h，测定酸度。

1.7 指标测定

酸度:采用GB 5413.34-2010方法;黏度:采用NDJ-8S数字式黏度计;菌落总数:采用GB 4789.35—2010方法。

1.8 感官评价

对于感官评价标准，将豆腥味和乳清析出作为研究重点，评价标准见表1。

表1 豆腥味和乳清析出情况评价标准Table 1 Standards of beany flavor and whey separation evaluation for fermented soybean milk

1.9 优化酸豆乳发酵条件的正交试验设计

在单因素试验结果的基础上，以酸豆乳的酸度为指标，以菌种配比(A)、接种量(B)、发酵温度(C)、发酵时间(D)4个影响因素，设计L9(34)的正交试验，优化发酵条件，因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels table of the orthogonal test

2 结果与分析

2.1 菌种的驯化结果

通过多次驯化后，得到图1的结果。由图1可以看出，随着豆乳含量的增加，St在培养液中酸度呈先增加后减少的趋势，酸度在豆乳含量为80%时达到最高;Lb在培养液中，酸度呈逐渐减少的趋势，酸度在豆乳含量为0%时为最高;Lp在培养液中，其酸度从含20%豆乳时开始呈先升高后下降的趋势，酸度在豆乳含量为80%时达到最高。在100%纯豆乳中，St和Lp的生长情况良好，酸度都能达到70.0°T以上(酸牛乳标准值)，但St酸度略低，而Lp酸度最高。

图1 St、Lb与Lp在驯化过程中不同发酵样品酸度的变化Fig.1 Acidity changes of different samples fermented by St，Lb and Lb during domesticating

由表3可以看出，驯化前3种菌在纯豆乳中的生长情况均不好，发酵终产品的菌数均偏低，未达到发酵乳国标中对菌数的要求(≥1×106CFU/mL)。驯化后，3种菌最终发酵产品的菌数均有所提高，尤其是St和Lp发酵产品，达到了国标要求，虽然Lb的发酵产品菌数仍未达标，但与驯化前相比，增加了一个数量级，说明驯化结果基本符合要求。

从驯化后的感官效果看:St发酵产品凝乳时间短，凝固效果好，基本无乳清析出，但有豆腥味，且组织较粗糙;Lb发酵产品凝乳时间较长，凝固效果较好，组织细腻，豆腥味极轻，有豆香味，但乳清析出较严重。Lp发酵产品凝乳时间短，凝固效果好，基本无乳清析出，醇香，无豆腥味，但有颗粒物感，不够细腻。为了获得更优质的酸豆乳产品，需综合驯化后的三种菌的优势，对其进行混种发酵研究和确定最佳工艺条件。

表3 St、Lb与Lp在驯化前后发酵豆乳的结果比较Table 3 Comparison of results of different samples fermented by St，Lb and Lb before and after domestication

2.2 St、Lb和Lp混种发酵菌种配比对发酵豆乳的影响

从图2和表4结果看，随着St和Lb的增加，产品的酸度逐渐降低，有部分乳清析出，以及轻微豆腥味;当提高Lp的量时，产品的酸度逐渐增加(幅度不大)，终产品伴有淡豆香味，几乎无豆腥味，但Lp量的增加产品会有颗粒物感，组织不够细腻。因此，综合上述结果，St、Lb 和 Lp 最佳配比为 1∶1∶1。

图2 St、Lb与Lp混种发酵菌种配比对发酵豆乳酸度的影响Fig.2 Effect of ratio of strains on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

表4 St、Lb与Lp在不同配比下制得的发酵豆乳的感官评价Table 4 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different ratios

2.3 接种量对发酵豆乳的影响

图3 St、Lb与Lp混种发酵接种量对发酵豆乳酸度的影响Fig.3 Effect of inoculum amount on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

从图3可知，产品的酸度随着接种量的增加而增加，当接种量为5%时酸度达到最高值，随后变化不大。从表5中感官指标看，接种量5%时，产品无乳清析出，组织状态细腻润滑，有淡豆香味，无豆腥味。因此，确定最适接种量为5%。

表5 St、Lb与Lp在不同接种量下制得的发酵豆乳的感官评价Table 5 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different inoculum amounts

2.4 发酵温度对发酵豆乳的影响

从图4和表6结果可知，随着发酵温度的提高，产品的酸度逐渐升高，乳清析出逐渐减少，豆腥味逐渐减轻，豆香味逐渐增加，40℃时呈现了最佳值，但当发酵温度为43℃时，酸度明显下降，豆腥味亦有所增加。因此，确定最适发酵温度为40℃。

图4 St、Lb与Lp混种发酵温度对发酵豆乳酸度的影响Fig.4 Effect of temperature on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

表6 St、Lb与Lp在不同温度下制得的发酵豆乳的感官评价Table 6 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different temperatures

2.5 发酵时间对发酵豆乳的影响

从图5看，发酵前段随着发酵时间的增加，产品酸度逐渐提高，发酵时间5～7 h时，酸度达到最高值并基本保持稳定，7 h后酸度有所下降。从表7感官结果看，发酵5 h时，产品没有豆腥味，亦无乳清析出，感官状态好。因此，确定最佳发酵时间为5 h。

图5 St、Lb与Lp混种发酵时间对发酵豆乳酸度的影响Fig.5 Effect of time on the acidity of soybean milk fermented by St，Lb and Lp

表7 St、Lb与Lp在不同时间下制得的发酵豆乳的感官评价Table 7 Sensory evaluation for soybean milk fermented by St，Lb and Lb at different times

2.6 正交试验结果

由于酸度是衡量酸乳中益生菌发酵优劣的一个重要指标［5］，因此，在上述单因素试验的基础上，以酸度值作为评价指标进行正交试验，结果见表8。

表8 正交试验数据分析表Table 8 Analysis of results table of the orthogonal test

由表8可知，发酵温度对酸度的影响最为显著，各因素对酸度影响的主次顺序为:发酵温度C＞发酵时间 D＞接种量 B＞菌种配比 A，最优条件为A2B2C2D2，即菌种配比 1∶1∶1，接种量 5%，发酵温度40℃，发酵时间5 h。

2.7 验证实验

根据正交试验确定的最优发酵条件，进行3次平行实验，得到的发酵酸豆乳的酸度为98.7°T，高于表中各项的实验结果，证实了正交试验优化结果的可靠性。在此最优发酵条件下，开发的发酵酸豆乳测定结果是:酸度 98.7 °T，黏度 3 875 mPa·s，菌数达到5.63×108CFU/g，而且产品凝乳效果好，无乳清析出，无豆腥味，口感细腻润滑，呈乳白色。

3 结论

(1)通过对所使用的3种菌种分别进行驯化，使其最终均能适应100%纯豆乳的生长环境。若将3种菌进行混种发酵，可相互取长补短，发挥更大的效果，为开发优质大豆酸乳奠定了良好的基础。

(2)通过单因素和正交试验，确定了利用嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌发酵100%纯豆乳的最佳工艺条件是:菌株配比1∶1∶1、接种量5%、发酵温度40℃、发酵时间5 h。在此优化条件下，开发的发酵酸豆乳产品在酸度和益生菌菌数方面均达到了酸乳国标要求，而且产品无豆腥味，口感风味和感官状态好，可为优质大豆酸乳加工提供技术参考。

［1］ 代养勇，曹健，董海洲，等.大豆食品豆腥味研究进展［J］.中国粮油学报，2007，22(4):50-53.

［2］ 曲冬梅，刘小杰.植物乳杆菌及其在食品工业中的应用［J］.中国食品添加剂，2008(增刊1):219-222.

［3］ 刘景春，杨桂玲，张岭.双歧杆菌新型保健酸豆奶的生产工艺［J］.大豆通报，2002(4):24-25.

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［5］ 张丽萍，杨晨，王成强，等.干酪乳杆菌在酸奶生产中的应用研究［J］.中国乳品工业，2007，35(2):23-26.