不同地区酿酒葡萄果实中酚类物质含量及抗氧化能力的分析*

蒋宝，罗美娟，张小转，张振文

1(渭南职业技术学院食品检测中心，陕西 渭南，714000)2(泾阳县园艺工作站，陕西泾阳，713700)

3(西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌，712100)

与其他酚类物质一样，葡萄酒中花色苷物质的组成和含量因葡萄品种、生态条件、栽培方式等不同而有不同程度的差异，从而最终影响到葡萄酒的质量。Jessica等［3］对黑比诺(Pinot Noir)葡萄果实的研究表明:照光果穗的果实中花色苷的总量显著地高于遮阴果穗;此外，Badja［4］对阿根廷门多萨地区不同海拔高度葡萄园(1 500米与870米)中的马尔贝克(Malbec)果实的研究表明:高海拔处葡萄果皮厚度是低海拔处的5倍。

我国葡萄酒产区分布较广，从东至西横跨距离超过2000公里，并且每个产区的气候和土壤条件各不相同，进而为这些地区生产不同风格的葡萄酒创造了生态条件。为此，本研究选取我国北方4个葡萄酒产区(包括宁夏玉泉营、山西乡宁、河北昌黎和沙城地区)主栽酿酒葡萄品种赤霞珠和梅鹿辄，通过光谱和色谱分析，对其葡萄果实中的酚类物质含量及抗氧化能力进行了评价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种为赤霞珠(Cabernet Sauvignon)和梅鹿辄(Merlot)，根据葡萄果实的糖酸比值确定其最佳技术成熟度，并于2011年10月前后采收葡萄。2个品种的葡萄果实均分别采自宁夏玉泉营慧彬公司(NXYQY)、山西乡宁戎子酒庄(SXXN)、河北昌黎朗格斯酒庄(HBCL)和沙城德尚酒庄(HBSC)，且具有代表性的葡萄园。2个品种均为实生根系，株行距为1.0 m×2.5 m、多主蔓扇形整枝，所有试验点栽培管理措施完全相同。

1.2 试验试剂

葡萄糖、酒石酸、没食子酸和乙酸乙酯等，天津市博迪化工有限公司;甲醇、甲酸、乙腈、乙酸均为色谱纯，Fisher(Fairlawn，NJ，USA)公司;儿茶素(Catechin)、二甲氨基肉桂醛(p-DMACA)、二甲花翠素葡萄糖苷(Malvidin-3-O-glucoside)、2，2-二苯代苦味酞基苯肼(DPPH)和水溶性VE(Trolox)Sigma-Aldrich公司。

1.3 主要仪器设备

UV-1800紫外可见光分光光度计，日本岛津公司;Eppendorf 5804R低温冷冻离心机，德国Eppendorf公司;Agilent 1100高效液相色谱仪-质谱，美国Agilent公司。

1.4 样品采集与提取液制备

采用“S”形取样法采集葡萄，将所采果实样品分为2份，一份直接破碎取汁，用于果实总糖、总酸和pH值的测定;另一份葡萄果实用液氮冷冻后研磨成粉末，再用酸化甲醇(V(体积分数60%甲醇)∶V(盐酸)=100∶0.1)重复提取3次，所有试验步骤均在避光条件下进行，提取液置于-40℃超低温冰箱中用于酚类物质及抗氧化活性的测定。

1.5 果皮花色苷的提取

将0.5 g的葡萄皮干粉倒入10 mL含体积分数2%甲酸的甲醇溶液中，超声提取10 min，再在25℃的摇床中避光提取30 min，然后以8 000 r/min低温离心8 min，转上清液于100 mL圆底烧瓶中，以上步骤重复4次，合并所有上清液，将上清液用旋转蒸发仪(30℃)蒸干，残渣用流动相(V流动相A∶流动相B=9∶1)定容至10 mL，-40℃下保存备用，样品进样前用 0.45 μm 滤膜过滤［5］。

1.6 测定项目及方法

1.6.1 基本理化指标的测定

四十年前，我参加了1978年的高考，那是我高中毕业11年后的高考。这11年里，我下乡当过知青，进工厂当过临时工。一次次地推荐工农兵大学生都没有我的份，一次次招正式工也没我的份。几番险被辞退，每念斯耻，汗未尝不发背沾衣。我以为我这辈子完了，没想到，1977年邓小平拍板的第一个改革，是恢复由于文化大革命冲击而中断的高考，并且不问考生家庭出身，这就给我带来了改变命运的机会。高考改变了我的命运，我衷心感谢文革后的第一个改革，还有推动这个改革的刘道玉、查全性教授。

总糖(以葡萄糖计)采用斐林试剂滴定法测定;总酸(以酒石酸计)用指示剂法(国标法)测定;pH值用酸度计法测定。

1.6.2 葡萄酚类物质的测定

总酚含量采用福林-肖卡法［6］测定，结果以每千克果实中含有的没食子酸表示;总类黄酮含量采用NaNO2-Al(Cl)3法［7］测定，总黄烷醇含量由 DMACA法［8］测定，结果均以每千克果实中含有的儿茶素表示;总花色苷含量由pH值示差法［9］测定，以1 kg果实中含有的二甲花翠素葡萄糖苷表示。

1.6.3 葡萄抗氧化能力的测定

DPPH·清除能力的测定参考Brandwilliams等［10］的方法，Cu2+还原能力的测定参考 Apak 等［11］的方法，结果均以1 kg葡萄果实中所含的Trolox表示。

1.6.4 葡萄果皮中花色苷物质的测定

葡萄果皮中花色苷的定性和定量分析在中国农业大学食品科学与工程学院葡萄与葡萄酒研究中心完成。利用HPLC-UV-MS/MS技术，结合离子的保留时间来进行定性分析［12］;以二甲花翠素葡萄糖苷作为标准物，并利用外标法结合标准曲线的方法对花色苷进行定量计算。

1.7 数据分析

采用SPSS16.0分析软件对实验数据进行分析，花色苷单体重复测定2次，结果以2次测定的均值表示，其他指标均重复测定3次。

2 结果与讨论

2.1 葡萄理化指标的分析

由表1可知，赤霞珠和梅鹿辄果实的总糖含量在198.6 ～224.1 g/kg和 187.3 ～218.9 g/kg，总酸含量在7.6 ～9.9 g/kg和6.9 ～8.9 g/kg，它们的糖酸比均不同程度地≥20。结果表明，尽管4个地区的生态条件迥异，但2个品种2011年的果实均获得较好的成熟度。

表1 4个地区赤霞珠和梅鹿辄葡萄果实的基本理化指标Table 1 The physicochemical index of Cabernet Sauvignon and Merlot berries from four different regions

2.2 葡萄多酚含量及抗氧化活性的分析

酚类物质含量丰富的原料是酿造高品质葡萄酒的重要条件。由表2可知，赤霞珠和梅鹿辄果实的总酚含量在 3 531.8 ～5 324.3 mg/kg和 2 451.8 ～3 229.2 mg/kg，其中宁夏玉泉营地区果实的总酚含量最高，河北沙城次之，其主要原因应该是地区间生态条件不同所致。类黄酮是葡萄果实和相应葡萄酒中含量最高、成分最为复杂、与葡萄酒质量最为密切的一类多酚物质。由表2可见，赤霞珠和梅鹿辄果实的类黄酮总量分别为 2 512.8～3 743.3 mg/kg和1 769.5 ～2 234.0 mg/kg，其中玉泉营地区赤霞珠果实中类黄酮含量是乡宁地区的1.5倍;对于梅鹿辄品种而言，除沙城最低外，其他3个地区相差不大。黄烷醇类物质与葡萄酒的涩味和抗氧化能力关系密切，玉泉营和河北沙城地区含量最高，尤其是玉泉营地区的含量约为山西乡宁和昌黎地区的1.4～2.1倍。

果皮中花色苷含量的高低主要决定于葡萄的品种，且花色苷含量高的葡萄原料是酿造色泽优质葡萄酒的必要条件。由表2可知，赤霞珠和梅鹿辄果皮花色苷总量分别在1 088.5 ～3 025.2 mg/kg和742.5 ～1 891.3 mg/kg，其中宁夏玉泉营地区含量最高，河北沙城次之，其他2个地区相差不大。而且，宁夏玉泉营地区的赤霞珠和梅鹿辄果皮花色苷总量分别是河北昌黎地区的2.5和2.8倍。研究结果进一步证实产区生态条件对果皮花色苷含量具有重要影响，且海拔较高、光照较强、昼夜温差较大的玉泉营地区的气候特征有利于葡萄果皮中花色苷含量的积累［13］。

表2 4个地区赤霞珠和梅鹿辄葡萄果实酚类含量及抗氧化能力的比较Table 2 Comparison of the total polyphenolics content and antioxidant activity of Cabernet Sauvignon and Merlot berries from four different regions

2种抗氧化指标(DPPH法和CUPRAC法)的测定结果均表明，玉泉营地区的赤霞珠和梅鹿辄果实抗氧化能力最强，沙城其次，乡宁和昌黎较低。这与玉泉营和沙城地区葡萄果实含有较高的多酚类物质相对应，说明酚类物质与抗氧化能力间的正相关性。此外，2种方法在4个地区的赤霞珠和梅鹿辄果实抗氧化能力间获得较好的协同性，但协同程度随测定方法而有所不同。例如，当选用DPPH法测定时，玉泉营地区梅鹿辄果实的抗氧化能力高于昌黎地区约26.0%，在 CUPRAC 法中，此值为30.1%。

2.3 葡萄果皮花色苷的分析

为进一步探究产区生态条件对果皮花色苷组成和含量的影响，本实验通过高效液相色谱(HPLC-UVMS/MS)在2个品种中分别检测到22和23种花色苷类物质，其中包括5种基本花色苷和18种花色苷衍生物(15种酰化花色苷和3种吡喃花色苷)。

由表3可知，5种基本花色苷(序号1-5)在4个地区的赤霞珠和梅鹿辄果皮中均被检测出，但彼此间的含量存在不同程度的差异。赤霞珠和梅鹿辄果皮中5种基本花色苷的总量分别为6 273.6～20 056.5 mg/kg和8 284.1 ～13 770.2 mg/kg，其中，宁夏玉泉营地区果皮基本花色苷的单体和总量均最高，其次是山西乡宁，其他2个地区相对较低。对于赤霞珠而言，玉泉营地区基本花色苷总量分别是河北沙城和昌黎地区的2.6和3.2倍;对于梅鹿辄而言，此值分别为1.3和1.7倍。由于本研究所用酿酒葡萄的田间管理措施完全相同，所以产区生态因素对葡萄果皮中5种基本花色苷含量能产生显著的影响，例如产区的温度、光照和降雨量等因素，且影响程度与品种特性密切关系。研究还发现，产区生态条件对葡萄果皮花色苷组成的影响主要表现在花色苷衍生物上。在4个地区的赤霞珠和梅鹿辄果皮中分别有6和9种花色苷衍生物的组成存在差异，但这类衍生物的含量相对较低。在所检测到的23种花色苷物质中，二甲花翠素葡萄糖苷的含量最高，这与前人的研究结果一致［14］。

3 结论

宁夏玉泉营地区赤霞珠和梅鹿辄果实的酚类物质(包括总酚、总类黄酮、总黄烷醇和总花色苷)含量最高，其次是河北沙城地区，而河北昌黎和山西乡宁地区含量互有高低。对4个地区葡萄果实抗氧化能力(DPPH法和CUPRAC法)进行测定，抗氧化能力强弱与其酚类物质含量呈正相关。产区生态条件对赤霞珠和梅鹿辄果实花色苷组成的影响主要表现在其衍生物上，对其含量的影响与品种特性有关。

表3 4个地区赤霞珠和梅鹿辄葡萄果皮花色苷组成和含量的比较 (ME mg·kg-1)Table 3 Comparison of anthocyanins composition and concentration of Cabernet Sauvignon and Merlot grape skins from four different regions(ME mg·kg-1)

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