藻蓝蛋白分离纯化技术及其影响因素分析*

赵静，祁岩，王月华，冯叙桥

1(渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州，121013)

2(美国加州大学戴维斯分校环境毒理系，美国加州戴维斯市，95616)

3(美国伊利诺伊理工大学食品安全与健康学院，美国伊利诺伊州芝加哥市，60616)

4(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳，110866)

藻胆蛋白是藻类特有的捕光色素蛋白，主要可以分为藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白。藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)是一种深蓝色粉末，它既是蛋白质又是良好的天然食用色素，多见于螺旋藻［1］、鱼腥藻［2］、地木耳［3］中，其中螺旋藻细胞中的蛋白质含量丰富，PC占总蛋白质的7%左右［4］。

PC具有抗癌、抗氧化、治疗脑缺血损伤、提高机体免疫力等多种生理功能，有关PC的研究已经成为天然海洋药物的研究热点［5］。PC的提取分离技术也成为时下人们所关注的问题之一。本文对近年来涌现出的PC提取和分离技术以及影响其分离纯化的因素加以整合，并进行了论述。

1 PC的分离纯化技术

传统的PC分离提纯技术一般通过超声、反复冻融、酶解和高压均质等方法使细胞裂解获得PC粗提液，之后将(NH4)2SO4沉淀法与多种色谱层析法结合使用［6］，从而达到分离纯化的目的。此类方法存在步骤繁琐、蛋白质损失量较大、难以规模化推广，且高于50%的生产成本用在纯化的过程中［7］等缺点。为解决PC纯度问题，近几十年来出现了一系列分离纯化PC的技术，其主要目标是为了改善PC的品质，它们的分离提纯工艺大致相同，但却在分离提纯时间、成本、回收率、纯度等方面各有所长。目前，PC常用的分离纯化技术有盐析、双水相萃取、反胶团萃取、柱层析等几种，下面分别对每种方法的特点进行介绍。

1.1 多步盐析

盐析(salting out)是现今蛋白质分离纯化中较常用的方法，主要通过向蛋白质溶液中加入浓的无机盐溶液［如(NH4)2SO4或Na2SO4溶液］，进而使蛋白质凝聚而析出。盐析是一个可逆的过程，不会影响蛋白质本身特有的性质。随着蛋白质分离技术的不断发展，研究人员对盐析方法有了新的改良，使之成为更适用于PC提纯的方法。

王巍杰等［8］以钝顶螺旋藻为材料，对多步盐析分离纯化进行了研究。他们采用反复冻融的方法将藻体细胞破碎，并将获得的PC粗体液依次进行两步盐析、四步盐析、六步盐析和多步盐析，进而分析盐析次数对PC回收率和纯度的影响。两步盐析即将PC粗体液分别置于 15%、20%、25%、30%的 4个(NH4)2SO4饱和梯度组中，4℃静置12 h后离心，取上清液，各组饱和度分别追加至45%、50%、55%、60%，在 4℃温度下静置 12 h，离心，沉淀用 PBS(0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液，pH=7，含 0.002 mol/L EDTA，简称PBS)溶解后测其吸光度，计算两步盐析后PC回收率和纯度。四步盐析即将二步盐析得到的粗体液分别置于 5%、10%、15% 的 3个(NH4)2SO4饱和梯度组中，4℃下静置12 h，离心，取上清，各组饱和度分别追加至33%、35%、37%，4℃静置12 h，离心，沉淀用PBS溶解后测其吸光度，计算四步盐析后PC的回收率和纯度。六步盐析即将四步盐析得到的粗体液分别置于20%、23%、25%、27% 的4个(NH4)2SO4饱和梯度组中，4℃静置12 h，离心，取上清液，各组饱和度分别追加至30%、35%、40%、45%，4℃静置12 h，离心，沉淀用PBS溶解后测其吸光度，计算六步盐析后PC的回收率和纯度。多次盐析即将六步盐析得到的上清液，加入(NH4)2SO4使其饱和度达到23%，4℃静置12 h，离心，上清液饱和度追加至35%，4℃静置12 h，离心，沉淀用PBS溶解后测其吸光度，如此反复多次。通过对比二步盐析、四步盐析、六步盐析以及多次盐析(NH4)2SO4饱和度对PC纯度和回收率的影响，可分析得知多次分段盐析的回收率虽然仅有9.66%，但PC 纯度高达3.92。

一般的盐析方法主要是先用(NH4)2SO4等盐类使PC析出，而后再利用层析等方法分离提纯蛋白质，步骤繁琐，而多步盐析法通过多次的分离而达到提纯目的，更加简易方便。

1.2 双水相萃取法

双水相萃取技术(aqueous two-phase extraction，ATPE)，又称水溶液两相分配技术(partion of two aqueous phase extraction)［9］，其原理主要是:在一定浓度下，2种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液体系会自然分成互不相容的两相，形成双水相体系，被分离物质进入双水相体系后，在表面性质、电荷间作用和各种作用力(疏水键、氢键和离子键)等因素的影响下，两相间的分配系数不同，导致上下相的浓度不同而达到分离的目的［10］。双水相萃取是一种新型的生物分离技术［11］，可用于PC的分离提纯。

刘杨等［12］采用反复冻融的方法将钝顶螺旋藻藻体破碎后，将获得的PC粗提液加入一定量的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和无机盐中，充分振荡使成相物质溶解，完成了PC在双水相系统中的分配过程。此双水相系统静置一定时间，当两相达到相分离后，分别抽取上下相的溶液，在波长280、620、650 nm下测吸光度，计算PC的质量浓度和纯度。结果发现，试验中双水相萃取分离得到的PC纯度为2.1，比采用盐析沉淀与层析分离相结合方法分离出的PC纯度低 3.4，但其操作简便［13］。

对比盐析的过程，双水相萃取法不仅节省了分离提纯的时间，简化了操作步骤，而且处理条件较为温和，可较好地保持蛋白质的活性［14-15］。然而，相比只考虑盐溶液的盐析过程来说，双水相萃取提纯PC需要考虑聚合物的浓度、种类、平均分子质量等因素，对于环境的要求较为苛刻。

1.3 盐析结合双水相萃取提取纯化法

盐析结合双水相萃取法(salting out combined two-aqueous phase extraction)是刘清新等［16］研究出的一种采用盐析和双水相萃取相结合的新型方法。此方法先用饱和度为35% ～75%的(NH4)2SO4溶液沉淀PC，再用饱和度为10% ～30%的(NH4)2SO4除去螺旋藻杂蛋白，而后在双水相系统中采用8%PEG 4000、16%柠檬酸钠和4%KCl分离纯化盐析后的PC。即先进行(NH4)2SO4的反复梯度盐析，而后将反复盐析后的PC溶液置于双水相系统中，达到分离提纯的目的。结果证明，经盐析结合双水相萃取提取纯化后的PC纯度可达4.0。

此方法结合了2种分离提纯PC的方法，虽然步骤较为繁杂，耗时较长，同时要兼顾影响2种方法的因子，但它大大提高了蛋白质的纯度，同时也为运用多种方法分离蛋白质提供了一个先例。

1.4 反胶团萃取法

反胶团萃取(reversed micellar extraction)是近年来一种新型的蛋白质分离提纯方法，它是利用表面活性剂在有机相中形成的反胶团(reversed micelles)形成分散的亲水微环境，从而使生物分子在有机相(萃取相)内存在于反胶团亲水微环境中，解决了蛋白质类生物活性物质难溶解于有机相中或在有机相中发生不可逆变性的问题。由于此方法选择性高、萃取过程简单［17］，可有效保护蛋白质大分子，因此成为提取PC的新型方法之一。

甘林火等［3］将地木耳细胞分离获PC粗提液，同时将配制好的阳离子十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)反胶团溶液与粗提液充分混合、静置分层，将油水两相分离(油相为反胶团萃取液)，抽取上相(油相)溶液并测定其PC含量，向油相中加入不同pH值的无机盐KBr溶液，使两相充分混合，PC达到分配平衡。再次静置分层，将油水两相分离，水相为反胶团反萃取液，抽取下相(水相)溶液并测定其PC含量。最终得到了最佳分离条件为0.05 mol/L CTAB/正己醇-正辛烷(体积比1∶4)的反胶团体系用于萃取pH=7.0的地木耳细胞破碎液，PC萃取率可达98.1%，分配系数达到50.7;采用 pH=4.0、3 mol/L KBr反萃液反萃取 PC，反萃率可达98.5%，其纯度可达16.8。

刘杨等［18］将加入磷酸缓冲液的螺旋藻粉采用反复冻融技术破碎藻体细胞，获得藻胆蛋白粗提液，并与CTAB反胶团溶液混合后离心，反复提取水相溶液，在568、620和650 nm下测吸光度，计算PC的含量。此外，刘杨等还分析了盐离子种类和浓度等对萃取效果的影响。

利用反胶团萃取法提纯PC可以有效地防止其变性，蛋白质的纯度也远远超过4.0，纯度大幅度提高，此类方法可适用于对蛋白质纯度要求较高的医疗行业。

1.5 壳聚糖亲和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25柱层析法

针对传统PC纯化能耗高、损失大、耗时长等缺点，廖晓霞［6］等探究出了壳聚糖亲和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25柱层析(chitosan affinity precipitation-activated carbon adsorption-DEAE Sephadex A-25 column chromatography)三步法分离纯化PC方法(图1)。通过分析壳聚糖亲和沉淀条件，活性炭吸附，DEAE Sephadex A-25凝胶层析洗脱曲线以及PC的光谱特性，得出向PC粗提液中加入0.29%壳聚糖，调节pH值至6.9，搅拌5 min后，离心弃沉淀，向上清液中加入80 g/L活性炭吸附5 min，离心、超滤浓缩上清液，采用DEAE Sephadex A-25柱层析法，用10 mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH 6.8)+0.1 ～0.3 mol/L NaCl梯度洗脱得纯度达到4.3的PC。

此方法所需材料成本低、考虑因素较少、条件温和、不易使蛋白质变性，可适用于工业化大生产，然而相比反胶团萃取法提纯蛋白质，其蛋白质纯度较低。

图1 壳聚糖亲和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25柱层析法提纯PC工艺流程Fig.1 Process of phycocyanin purification by chitosan affinity precipitation-activated carbon adsorption-DEAE Sephadex A-25column chromatography

1.6 离子交换色谱与疏水间相互作用色谱结合法

离子交换色谱与疏水间相互作用色谱结合法(combined ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography)是将提取后的PC先后经过离子交换色谱法、疏水间相互作用色谱法来进一步纯化PC。Santiago-Santos等［19］将从稻田中分离的丝状蓝藻，经一定条件培养后离心分离，沉淀悬浮于10 mL 0.1 mol/L、pH=7 磷酸盐缓冲液中(含有 13.6 mmol/L的EDTA和2 mg单位湿重为2 mg/g溶解酶)，悬浮液静置24.5 h使细胞破碎，经再次离心后获PC粗提物。粗提物用50 mmol/L pH=7.5 Tris-HCl缓冲液(经过PD10柱)平衡，使其可以在相同的条件下进行离子交换。进行离子交换色谱时，首先将样品装入经50 mmol/L、pH=7.5的Tris-HCl缓冲液平衡后的Q-Sepharose 4快速流动柱中，用14 mL相同的缓冲液洗脱，吸附的蛋白质被10 mL具有线性梯度(0 ～0.6 mol/L)的 NaCl缓冲液(50 mmol/L、pH=7.5的Tris-HCl)洗脱，收集 A620/280检测后大于1.5的组分与1.3 mol/L的(NH4)2SO4混合，随后将其装入用pH=7.5 Tris-HCl缓冲液平衡后的且含有 1.3 mol/L的(NH4)2SO4甲基宏观准备柱，用30 mmol/L平衡缓冲液洗脱，蛋白质用25 mL含有线性梯度(0 ～1.3 mol/L)的(NH4)2SO4洗脱，收集 A620/280检测后大于3.5的组分。

此方法在预处理过程中未采用反复冻融法，而是通过生化手段使细胞破碎，通过增加细胞的破碎程度来提高回收率。然而，此方法在预处理方面所需时间较长，纯化步骤也较为繁琐，不适用于工业化大生产。

上述主要介绍了近年来研究的6种PC的分离纯化方法，这些方法各有优势，也各有不足之处(表1)。在考虑实际应用时，需要根据实际情况，例如是否可以工业化生产、纯化率、回收率等，选用适当的分离提纯方法。

表1 PC分离纯化技术方法对比Table 1 Comparison on advantages and disadvantages of phycocyanin separation and purification technologies

2 影响PC分离提纯的因素

当选用适当的PC分离提取方法时，为达到尽可能大的回收率、纯化率，节省时间，需要考虑各种影响因子(表2)，对每个因子的适用条件加以分析，使其达到最优化的程度，进而达到更好的提纯效果。

2.1 盐析次数

此因素主要影响与盐析过程有关的方法，例如多步盐析法［8］和盐析结合双水相萃取法［16］。王巍杰等［8］在提取PC时进行了多次分段盐析，分析了盐析次数对PC回收率和纯度的影响。在4次盐析实验结果中得出，随着盐析次数的增多，PC的回收率降低，但PC的纯度呈现出先升后降的趋势，纯度在第3次的盐析操作中(23%除杂，35%沉淀PC)最高，为3.92，表明增加盐析次数可在一定程度上提高蛋白质的纯度，然而过多次数的盐析则会适得其反，因此需要经多次试验找出最适的盐析次数，使PC纯度的达到峰值。

2.2 聚合物平均分子质量

此因素主要影响与双水相萃取过程有关的方法，例如双水相萃取法［12］和盐酸结合双水相萃取法［16］。PEG的平均分子质量极大程度地影响着双水相体系的平衡。刘杨等［12］选用了平均分子质量分别为600、1 000、2 000、4 000、6 000，质量分数为 10% 的PEG，观察溶液的分层情况。结果发现，在PEG分子质量为4 000时，溶液开始出现分层现象。因此，在相同的聚合物和无机盐浓度下，PEG平均分子质量低的溶液不能形成双水相体系，PEG分子质量越大，越容易形成双水相体系，但PEG分子质量过大，不会对PC纯度有明显的提高作用。

2.3 表面活性剂的浓度

此因素主要影响反胶团萃取法的提纯效率。刘杨等［18］采用浓度分别为 0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L的CATB阳离子表面活性剂，从PC的萃取现象、萃取率、分配系数、分离因数方面分析表面活性剂浓度对反胶团萃取PC的影响。通过实验可知，随着CATB浓度的增加，油水液面变得逐渐清晰，PC的萃取率和分配系数都在逐渐增加，CATB浓度在0.04 mol/L最好，然而分离因数的变化却不显著。而且，当CTAB浓度增加到一定程度(高于0.05 mol/L)时，有机相黏度增大的程度会影响油水两相的分层速度，因此在利用反胶团萃取法萃取PC时，0.04 mol/L为较适合的阳离子活性剂浓度。

2.4 活性炭加入量

该因素主要针对壳聚糖亲和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25柱层析法对PC的提纯效果。廖晓霞等［6］的研究表明，活性炭可用来纯化PC。实验表明，用活性炭处理PC粗提液5 min，即可达到纯化PC的目的，但处理时间的过度延长，不但不能进一步提高PC的纯度，反而较大程度地影响了PC的得率。为进一步研究出活性炭加入量对蓝藻蛋白提纯效果的影响，他们采用浓度分别为20、40、60、80、100 g/L的活性炭，分析PC的得率和纯度。结果表明，随着活性炭浓度的增加，PC的得率逐渐降低，纯度则呈现一个峰值。因此，在考虑了PC的得率和纯度因素后，活性炭的最适浓度选择为出现纯度峰值时所对应的活性炭浓度(80 g/L)。

表2 PC分离提取方法及其主要影响因素Table 2 Main influencing factors of phycocyanin separation and purification technologies

3 现有问题与建议

尽管人们对于PC有了一定的关注，研究人员也研制出了多种提纯方法来满足人们对于PC的需要，但目前我国对PC分离提取方法的研究还不够完善，主要表现在以下几点:

(1)现有PC分离提纯技术在产品安全方面有待完善。近年来，由于工业废水造成的环境重金属污染，例如铬污染以及水体富营养化造成的有毒藻类污染、微囊藻毒素污染，使藻类原料面临着重金属和蓝藻毒素污染的风险［27-30］，对PC的质量造成威胁。然而，在PC的分离提纯中，鲜有去除重金属、藻类毒素的考量和相关检验等工序，这给PC的使用安全性，特别是医疗保健和化妆品等行业，无法提供完全的保障。因此，在将来的PC分离纯化技术研究中，要这种解决重金属和蓝藻毒素污染去除的问题。

(2)提取PC时所用的化学试剂得不到较好处理，造成了严重的环境污染。例如，在PC的提纯过程中研究人员可能用到(NH4)2SO4试剂，如处理不当排入水中，会造成氨氮污染。2009年《中国环境统计年报》显示，我国废水中的氨氮排放总量已达122.6万t，相当于受纳水体环境容量的4倍左右。其中化工等以高浓度氨氮废水为主的8个行业的氨氮排放量占全国工业氨氮排放总量的85.9%。水中氨氮在一定条件下可转化为亚硝酸盐，如果长期饮用，水中的亚硝酸盐将和蛋白质结合成亚硝胺，亚硝胺是一种强致癌物质，严重影响人体健康［31］。因此，要特别注意提取技术的应用，不能造成环境水体污染。

(3)现有PC分离纯化技术的产品品质不理想。例如，现在常用的多步盐析法，虽节省操作成本，但回收率却较低;双水相萃取法虽然萃取条件温和，但不易与聚合物分离。由此可见，每一种方法都有其优势，同时存在不足之处，进而影响提纯PC的品质。

针对上述3个方面问题，建议从下述3个途径加以解决:

(1)研究人员应该注重改善水体中氮、磷的营养结构，抑制有毒藻类的生长方法的研究［31］，研究对诸如重金属和蓝藻毒素等易掺入PC中的有害物质的特殊有效的检测方法，例如高效液相色谱检测或酶联免疫吸附检测［33］，以进一步提高PC的纯度，保证PC质量安全性。同时，要让人们正确认识PC的成本与价格的关系，对价格低廉的PC，人们应注意其纯度和添加物。

(2)加大对相关化学药品的回收处理力度，加强对回收化学药品有效处理方法的研究，严禁私自将化学试剂倾倒入河流湖泊，对于工业用或化学用药品要预先做好方案规划，进行多部门的综合监督和多学科参与的研究，避免环境污染和资源浪费［34］。

(3)研究开发新技术，鼓励研究人员对蛋白质提纯方法的创新。可将不同的蛋白质技术提纯方法组合，弥补相互缺陷，达到更大地提高蛋白质纯度的目的。例如王巍杰等［8］采用多步盐析法获得的PC的纯度为3.92，而刘清新等［16］采用盐析结合双水相萃取法纯度可达4.0。

4 展望

PC有着多重作用，它可以作为天然色素，应用于食用工业和化妆品行业中;可以作为医药保健用品，起到抗氧化、消炎等功效;也可以因其荧光特性而作为生物学、细胞学等学科的研究试剂，应用前景十分广阔。此外，我国幅员辽阔，淡水藻类资源丰富，PC生产有着充足的原料来源。然而，仅仅有丰富的资源还不够，一方面，市场内高纯度的PC已被国外垄断，其售价极高，例如食品级的PC(纯度高于0.7)售价达到0.13 US$/mg，分析级的PC(纯度高于4.0)售价达到15 US$/mg;另一方面，我国对于PC的研究开发大都处于实验室水平，其成熟的工艺技术还需要一段时间的研究探索［35-37］。因此，还需要加大分离提纯方法的研究力度，从提纯技术方法组合、仪器设备使用、环境保护、PC质量安全和PC质量保证［38］等方面尽快研究出既可以提高纯度、加大回收率、节省时间，又可以节约成本、适合于工厂化生产的最优化方法。

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