乾州板鸭加工中肌肉蛋白质及肌纤维的降解规律分析

杨万根，谢琼，朱秋劲，顾仁勇，黄群，余佶

1(吉首大学食品科学研究所，湖南吉首，416000)2(贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳，550025)

乾州板鸭是湘西吉首地区具有浓郁地方特色的传统肉制品，制作的历史可以追溯到清末时期。乾州板鸭以湘西麻鸭为原料，用肉桂、丁香、川椒、山奈、八角、白胡椒等上等香料制成的混合盐香料进行腌制。制作精良的乾州板鸭呈琵琶形，色泽金黄，油光发亮，肉质细嫩，味香可口，风味独特。

乾州板鸭要经过长达20余天的腌制和15d风干过程才能形成其独特的风味。在此过程中，由于内源酶作用和微生物的作用，板鸭中会发生各种生化反应，其中包括蛋白质的降解作用，形成氨基酸、肽类、有机酸等小分子物质［1］。目前，国内对南京板鸭研究较多［2-3］，但由于2种板鸭的制作工艺不同，因此乾州板鸭的蛋白质降解规律会与之存在差异。本研究以不同加工阶段的乾州板鸭样品为研究对象，通过SDS-PAGE电泳和扫描电镜观察蛋白质的降解及肌肉纤维的变化情况。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

乾州板鸭，麻鸭，购于乾州农贸市场，宰杀去毛，去除内脏，洗净，用香料腌制，出缸风干;小分子标准样品、牛血清蛋白、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、TEMED、β-巯基乙醇，Sigma 公司;SDS、NaH2PO4、Na2HPO4、KI、迭氮钠、甘油、溴酚蓝、甲醇、冰醋酸、Tris碱、过硫酸铵、HCl、甘氨酸、戊二醛、乙醇、CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、磺基水杨酸、KOH，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 实验仪器

EPS-300电泳仪、VE-180垂直电泳槽，上海天能科技有限公司;FD5-2.5冷冻干燥机，Sim International Group;722可见分光光度计、JA2003电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;PHSJ-4A pH计，上海精密科学仪器有限公司;FHS-2高速匀浆机，金坛市亿通电子有限公司;HH-S2恒温水浴锅，金坛市成辉仪器厂;TG165医用离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司;THZ-82A水浴恒温振荡器，金坛市顺华仪器有限公司;FESEM JEOL 6700F扫描电子显微镜(SEM)，日本电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 全肌肉蛋白的提取

采用Bechtel［4］的方法，将 4 g鸭胸肉剪碎，加入10 mL 提取液(2%SDS，10mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.0)，然后匀浆 30 s，离心(1 500 × g，15 min)，所得上清液即是全肌肉蛋白溶液。

1.2.2 肌浆蛋白的提取

采用 Bechtel［4］的方法，称取 2 g 剪碎肉样，加入20 mL 0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸盐缓冲液(PBS)，使用高速分散器在6 000 r/min下匀浆3min，在离心力10 000×g及4℃下离心20 min，所得上清液即为肌浆蛋白。

1.2.3 肌原纤维蛋白的提取

采用Bechtel［4］的方法，上述离心沉淀重新悬浮于0.03 mol/L pH 6.5的PBS溶液中，在高速分散器中匀浆(6 000 r/min，4 min)，然后离心(10 000 × g，4℃，20 min)，去除上清液，重复以上操作3次，除去肌肉中的内源蛋白酶，最终沉淀再次悬浮于8 mL 0.1 mol/L pH 6.5的PBS中，另加入KI和迭氮钠使最终浓度分别为0.7 mol/L和0.02%，悬浮液在高速分散器中匀浆(7 000 r/min，3 min)，然后离心(10 000×g，4℃，20 min)，吸取上清即为肌原纤维蛋白。

1.2.4 蛋白质浓度测定

用双缩脲法［5］测定蛋白质浓度，标准蛋白为牛血清蛋白。

1.2.5 SDS-PAGE 电泳方法

采用Laemimli［6］不连续SDS-PAGE 电泳系统，并参照汪家政等［7］和郭尧君［8］的方法。分离胶浓度为14%，浓缩胶浓度为4%。

1.2.6 肌纤维的SEM测定

将样品细切成(0.3 ×1.0 ×1.0)cm 肉片，在2.5%戊二醛中于4℃下固定3 d，然后用体积分数30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液逐级脱水(每级脱水30 min)，再浸在乙酸异戊酯中置换30 min。完成置换的样品冻干，粘台，喷金，SEM观察、拍照。

2 结果与讨论

2.1 全肌肉蛋白的SDS-PAGE电泳

全肌肉蛋白由10%的结缔组织蛋白、30%的肌浆蛋白和60%的肌原纤维蛋白构成。由图1可知，在板鸭的加工过程中，第7天样品的电泳图与原料肉相似，说明全肌肉蛋白降解不明显，但到了第14天，39 kDa条带明显消失，22 kDa条带明显变弱，说明全肌肉蛋白在此时有了明显的降解。腌制第21天、风干第7天和第14天产品与腌制第14天产品相比，蛋白质条带分布变化不大，但12 kDa处条带随加工时间延长颜色变深，说明小分子质量多肽增加。

全肌肉蛋白发生降解，既可能是由内源蛋白酶作用，也可能是因微生物生长而分泌的外源蛋白酶作用。但从图1看，39 kDa条带和22 kDa条带在4℃条件下腌制第14天时即有了较明显的降解，因此微生物产生蛋白酶分解的可能性不大。因此推测，在乾州板鸭加工中所发生的肌肉蛋白质降解主要是内源蛋白酶的作用。据报道，肌肉中起到降解蛋白质作用的内源蛋白酶主要是组织蛋白酶和钙激活蛋白酶［9-10］。组织蛋白酶来源于肌细胞浆中的溶酶体，目前已经发现近20种组织蛋白酶，其中的组织蛋白酶B、D、H和L在动物屠宰后的肌肉蛋白质降解中发挥关键的作用［11］。钙激活蛋白酶则在肉的成熟和嫩化作用中居于中心地位［12］。但研究发现，钙激活中性蛋白酶具有自溶作用，随着腌制时间的延长，肉中钙激活蛋白酶的活力逐渐下降，最后几乎能完全失去活性［13］。Rosell等报道，火腿中钙激活酶降解蛋白质的作用仅发生在腌制的最初2周内［14］。而组织蛋白酶在肉制品腌制过程中都有活性，例如在干腌火腿加工结束时仍保持约5%的活性［15］。因此，在腌制第21天前，由于组织蛋白酶和钙激活蛋白酶的共同作用，蛋白质较快的降解，但之后钙激活蛋白酶活力减弱甚至消失，组织蛋白酶引起的蛋白质组分变化较小，导致图1中腌制第21天后的样品之间蛋白质组分分子量差异不大。

图1 板鸭加工过程中全肌肉蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE of muscle protein during dry-salted duck processing

2.2 肌浆蛋白的SDS-PAGE电泳

图2 板鸭加工过程中胸肉肌浆蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE of breast sarcolasmic protein during dry-salted duck processing

从图2看出，在板鸭加工各阶段中，原料样的39 kDa处条带在腌制第7天时已经变弱，在腌制第14天时消失，这与全肌肉蛋白前14 d变化规律一致，说明全肌肉蛋白39 kDa处的条带变化是来源于肌浆蛋白的变化。15 kDa处条带随加工的进程逐渐加深，到风干第14天时，形成了明显的条带，14 kDa处条带也逐渐加深，说明板鸭在腌制过程中蛋白质不断发生降解，形成的多肽数量增多。

2.3 肌原纤维蛋白的SDS-PAGE电泳

肌原纤维蛋白由肌动蛋白、肌动球蛋白和肌球蛋白等组成，对肉制品的凝胶特性有重要影响［16］。

图3 板鸭加工过程中胸肉肌浆蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.3 SDS-PAGE of breast myofibrilar protein during dry-salted duck processing

如图3所示，在板鸭的加工过程中，肌原蛋白的61 kDa条带和43 kDa条带在板鸭的加工过程中逐渐增强，可能是加工过程中大分子条带发生降解而成;而21 kDa条带逐渐消失，则是这部分蛋白发生了水解。从腌制21天到风干第14天，条带变化不大，说明肌原纤维蛋白在这段时间内降解不明显。

2.4 肌肉纤维的SEM结果

乾州板鸭加工过程中肌肉纤维的变化如图4所示。原料肉的肌纤维排列有规律、紧密，是完整的肌纤维，冻干后肌纤维间空隙很小。腌制14 d后，肌纤维的排列开始变得松散，冻干的样品肌肉间空隙增大，但还呈较完整的肌纤维。风干7 d后，完整的肌纤维开始断裂成几截。风干14 d后，肌纤维断裂的情况加剧，并且肌纤维的数量减少，空隙明显增大。由SDS-PAGE分析结果可知，在腌制前14 d肌肉蛋白质降解比较明显，在腌制第21天至风干第14天，虽然有一定的蛋白质降解，但不明显。因此可知，在腌制前14 d肌肉纤维内部发生了蛋白质的降解，但没有显现出来，在之后继续的降解中，肌纤维结构快速崩解。

图4 肉样的电镜扫描图(a为放大100倍，b为放大200倍)Fig.4 Scanning electron micrograph of the meat

3 结论

细胞中的蛋白质降解主要有四条途径:溶酶体途径，线粒体蛋白酶系统途径，泛素-蛋白酶体途径和胞液蛋白水解途径［17］。动物屠宰后，由于许多内源酶如钙激活酶、组织蛋白酶类的分解作用，肌肉蛋白质发生降解。在乾州板鸭的加工过程中，全肌肉蛋白、肌浆蛋白和肌原纤维蛋白在腌制的前14 d有明显降解，而从腌制第21天到风干第14天，肌肉蛋白降解不明显。板鸭的肌肉纤维在经过腌制和风干后，从排列紧密变得松散，从完整的纤维断裂成几截，肌纤维的数量减少，肌纤维间的孔隙增大。

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