优化絮凝复合菌在马铃薯淀粉废水中培养及资源化处理条件的研究

张怀予，彭 涛，马文锦，张小燕，陈兴叶，殷 欣，路宏科，金 红，杨旭星

(甘肃省轻工研究院，甘肃兰州730000)

甘肃省是我国马铃薯主产区之一，总产量位居全国第一，马铃薯淀粉的加工是我省的主导产业［1］。马铃薯淀粉加工中，平均每生产1t淀粉需消耗6.5t左右的马铃薯，排放20t左右的废水，废水含有大量糖类、蛋白质、矿物质等，CODCr通常 8000～30000mg/L，蛋白质含量在 2000～8000mg/L［2］。若此废水直接排放不仅污染水体，且浪费资源。研究一种快速、高效、低耗的淀粉废水处理方法则是当务之急。我国薯类淀粉行业废水处理方法主要有生物法和絮凝沉淀法［3］。生物处理法一般分为耗氧和厌氧生物法，运行时必须几种工艺方法串联使用。该工艺不仅占地面积大，能耗大，而且运行成本高，处理周期长，易受环境条件影响。絮凝沉淀法成本较低、工艺简单、适应性强，尤其能降低薯类淀粉废水的浊度和色度，去除多种高分子有机物而被广泛采用［4-5］。絮凝剂是整个处理技术的关键，决定着废水处理的效果，常用无机、有机和微生物絮凝剂(Microbial flocculants，MBF)［6-7］。传统絮凝剂在使用中具有不安全性、对环境造成二次污染等缺点，在许多领域已禁止或限量使用［8-9］。而MBF是由微生物产生并具有絮凝活性的代谢产物，主要有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA以及有絮凝剂活性的菌体等［10-12］，是具有应用范围广、絮凝活性高、安全无毒、无污染、能自然降解、脱色效果独特等特点的新一代絮凝剂［13-14］，且多种微生物组成复合菌群后，通过共生、协调作用所产絮凝活性将会比单一菌株所产絮凝效果更好，对环境变化的适应性也更强［15-16］。另外，生产菌的种类繁多、生长快，更易实现工业化。

本研究拟在马铃薯淀粉废水中优化絮凝复合菌的培养和将其用于废水处理的絮凝条件。实验将薯类淀粉废水处理的生物法和絮凝沉淀法结合，处理后回收的絮凝沉淀物质还可以作为动物饲料添加剂进行综合利用，旨在提高马铃薯淀粉废水的利用率和提供资源化处理废水的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马铃薯淀粉废水 甘肃薯界淀粉集团有限公司;牛肉浸膏(生化试剂) 上海乳品厂;高岭土、硫酸亚铁、硝酸钾、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、乙醇、磷酸氢二钾、氯化钙 均为分析纯;供试菌株 甘肃省轻工研究院食品发酵室筛选的 N1短杆菌(Brevibacterium sp.)和 N2短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)组成;牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，pH7.0～7.2，水 1000mL，121℃灭菌20min。保藏、复壮菌株时则采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，复合菌构建选用牛肉膏蛋白胨液体培养基。

恒温摇床 上海天呈科技有限公司;培养箱 上海精密仪器仪表公司;高压灭菌锅 上海茸研仪器设备有限公司;pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;电子天平 奥豪斯国际贸易有限公司;7200型分光光度计 上海合利仪器有限公司;UV756CRT紫外分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司;PB203-N型分析天平 Metler-Toledo公司;六联搅拌器 武汉市梅宇仪器有限公司;XSP-10C显微镜 上海光学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株活化复壮 菌株复壮参照纯种分离法，4℃保存试管中分别挑取1环菌种，连续两次经划线或梯度稀释转接于牛肉膏蛋白胨琼脂平板，30℃培养 72～96h，得到纯菌落［17］。

1.2.2 构建复合菌 分别挑取复壮菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养24h，取1mL各菌悬液按等体积进行复配，于30℃ 150r/min液体发酵培养48～72h 形成复合菌液［18］。

1.2.3 马铃薯淀粉废水培养絮凝复合菌营养条件的优化 以马铃薯淀粉废水为主要培养基质，30℃150r/min摇床培养48h，高岭土絮凝率为测定指标，通过单因素分析实验，确定添加碳源、氮源、无机盐种类和浓度，以及初始pH对复合菌培养的影响，每个实验2个平行。

1.2.3.1 碳源种类和投加量对絮凝率的影响 在未添加营养物质的废水中分别添加1g的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉及1mL的无水乙醇、甘油作为外加碳源，定容至100mL于300mL三角瓶中，加入1mL复合菌液发酵培养，分别测定絮凝率，并以不加碳源的废水为对照。

在100mL的废水中对选出的碳源，按照单因素法以絮凝率为指标，确定其最佳投加量。

1.2.3.2 氮源种类和投加量对絮凝率的影响 在废水中(补充确定了种类和投加量的碳源)分别添加0.1g 尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CI、蛋白胨、酵母膏，定容至100mL于300mL三角瓶中，加入1mL复合菌液发酵培养，考察其对絮凝率的影响，并以不加氮源的废水为对照。

在100mL补充了碳源的废水中对选出的氮源，按照单因素法以絮凝率为指标，确定其最佳投加量。

1.2.3.3 无机盐种类和投加量对絮凝率的影响 在废水中(补充确定了种类和投加量的碳源、氮源)分别添加 0.05g NaCl、KH2PO4、FeSO4、KCl、MgSO4，并定容至100mL于300mL三角瓶中，加入1mL复合菌液发酵培养，考察其对絮凝率的影响，并以不加无机盐的废水为对照。

在100mL补充了碳源、氮源的废水中对选出的无机盐，按照单因素法以絮凝率为指标，确定其最佳投加量。

1.2.3.4 不同初始pH条件下培养复合菌对絮凝率的影响 在100mL废水中(补充确定了种类和投加量的碳源、氮源、无机盐)分别调节初始 pH为4、5、6、7、8、9，进行发酵培养，考察其对絮凝率的影响。

1.2.3.5 优化营养条件 依据单因素实验结果，以主要影响因素乙醇、NH4NO3、KH2PO4和pH为考察因素，分别选取3个水平，高岭土絮凝率为指标，通过L9(34)正交实验设计，对马铃薯淀粉废水培养复合菌的营养条件进行优化，以确定最佳培养方案，因素水平表见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 马铃薯淀粉废水中絮凝条件的优化 通过单因素分析实验，确定马铃薯淀粉废水所培养的絮凝复合菌投加量、废水pH、助凝剂种类和浓度、沉降时间和搅拌速度对马铃薯淀粉废水COD去除率影响，每个实验重复2次。

1.2.4.1 复合菌投加量对COD去除率的影响 将最适营养条件下发酵培养的复合菌，分别按0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2mL 添加，并加入 3mL 1%CaCl2溶液，废水定容至100mL，140r/min搅拌5min，静置10min，测定对COD去除率影响。

1.2.4.2 废水不同pH对COD去除率的影响 添加1mL的废水培养复合菌、3mL 1%CaCl2溶液，用废水定容至100mL，并调节 pH 为3、4、5、6、7、8、9，140r/min搅拌5min，静置10min，测定对COD去除率影响。

1.2.4.3 助凝剂种类和浓度对COD去除率的影响 添加1mL的废水培养复合菌，300μL 1mol/L NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl3、AlCl3溶液，用废水定容至100mL，140r/min 搅拌 5min，静置 10min，测定COD去除率影响。

确定了助凝剂种类后，按照单因素法以COD去除率影响为指标，确定其最佳投加量。

1.2.4.4 沉降时间对COD去除率的影响 加入1mL的废水培养复合菌和3mL 1%CaCl2溶液，用废水定容至100mL，140r/min 搅拌5min，分别静置5、10、15、20、25、30min后，测定对COD去除率影响。

1.2.4.5 搅拌速度对COD去除率的影响 加入1mL的废水培养复合菌和3mL 1%CaCl2溶液，用废水定容至100mL，分别在 100、140、180、220、260、300r/min条件下搅拌，静置10min，测定对COD去除率影响。

1.2.4.6 响应面优化实验 在单因素实验基础上，根据Box-Behnken实验设计原理，选择对絮凝效果影响较大的3个因素为自变量，即絮凝复合菌投加量、助凝剂CaCl2用量、搅拌速度，以COD去除率为响应值，利用响应面实验设计对马铃薯淀粉废水的絮凝条件进行优化，以确定最佳絮凝沉淀方案，因素水平表见表2。

表2 响应面实验因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design

1.2.5 絮凝效果分析 在最佳絮凝沉淀条件下，对马铃薯淀粉废水进行资源化处理，测定废水的COD和浊度值，并回收粗蛋白物质。

1.2.6 测定方法

1.2.6.1 絮凝率 于蒸馏水中加入1mL菌发酵液、3mL 1%CaCl2溶液、0.5g高岭土定容至 100mL，300r/min搅拌 0.5min，140r/min搅拌 5min，静置10min，以不加絮凝剂的高岭土悬浊液为对照，注射器吸取上清液液面下1cm处液体测其OD550吸光度值［19-20］。

A:为对照所测吸光度值;B:加入絮凝剂样品的吸光值;絮凝率:表示投加絮凝剂前后，水样中悬浮物去除率。

1.2.6.2 COD去除率 于马铃薯淀粉废水中加入1mL絮凝剂溶液、3mL 1% CaCl2溶液，定容至100mL，并用搅拌器于 140r/min搅拌 5min，静置10min，以马铃薯淀粉废水溶液为对照，吸取上清液，测定絮凝后废水溶液的COD，计算COD去除率［21］。

A:为对照所测COD值;B:加入絮凝剂样品的COD值。

1.2.6.3 马铃薯淀粉废水水质及粗蛋白物质的测定 化学需氧量(COD)测定方法同GB 11914-89《水质化学需氧量的测定重铬酸钾法》［22］;悬浮固形物含量(SS)采用干燥恒重法测定［19］;总氮(TN)测定方法同HJ 636-2012《水质 总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》［23］;总磷(TP)测定方法参照GB 11893-89《水质总磷的测定 钼酸铵分光光度法》［24］;pH 采用酸度计测定。

粗蛋白物质的测定方法参照GB/T 6432-94《饲料中粗蛋白测定方法》［25］。

1.3 数据处理

正交分析采用DPS 7.05处理软件，响应面分析采用Design-Expert 8.0.6设计软件。

2 结果与讨论

2.1 马铃薯淀粉废水培养絮凝复合菌营养条件的优化

2.1.1 马铃薯淀粉废水水质分析 为了充分利用废水培养复合菌产生高效的絮凝活性物质，则测定马铃薯淀粉废水的水质。如表3所示，废水中含有大量的有机物质，其中COD为8537mg/L，SS为221mg/L，TN为756mg/L，TP为92.1mg/L，并偏酸性，为微生物提供了良好的生长环境，也严重超过了国家标准GB 25461-2010《淀粉工业水污染物排放标准》，必须经过有效治理，方可进行排放。

表3 马铃薯淀粉废水水质特征Table 3 Characteristics of potato starch wastewater

2.1.2 营养条件的优化

2.1.2.1 营养条件种类、投加量及pH对絮凝率的影响 在马铃薯淀粉废水中添加不同碳源后，结果如图1A所示，6种碳源均能被复合菌利用，其中以乙醇和蔗糖为碳源时，所产微生物的絮凝活性较高，絮凝率分别达到82.01%和71.87%，之后为葡萄糖、淀粉、甘油和果糖，分别为 49.27%、32.15%、28.13%和18.17%。当废水添加最佳碳源乙醇后，结果如图1B所示，随着添加量的增加，絮凝率呈单峰变化趋势，当投加量增加至1.5mL/100mL时，絮凝率达到最大值88.10%，之后则迅速下降，表明碳源浓度对微生物的培养和絮凝剂的产生在1～2mL/100mL之间为最佳范围。

在补充1.5mL/100mL乙醇为碳源后，分别在废水中添加不同种类的氮源，结果如图1C所示，6种氮源均能被复合菌所用，其中以添加硝酸铵对复合菌产絮凝剂的絮凝效果影响最显著，絮凝率达到89.36%，之后依次为氯化铵、蛋白胨、硫酸铵、尿素、酵母膏，絮凝率分别为82.55%、78.31%、64.20%、55.59%、53.88%。图1D表明随着NH4NO3添加量的增加，复合菌产絮凝剂的絮凝率先增高，当添加量为0.2g/100mL时，达最大值90.62%，之后则开始迅速下降，表明氮源过高或过低都不利于复合菌产絮凝剂。

图1 营养条件种类、投加量及pH对絮凝率的影响Fig.1 Effects of different additional nutrition sources，dosages and pH on flocculating activity

图1E结果显示，在补充了1.5mL/100mL碳源乙醇和0.2g/100mL氮源NH4NO3的废水中，添加5种无机盐后，对絮凝活性均有影响，其中絮凝效果最好的为磷酸二氢钾，絮凝率达到91.84%，其次为硫酸亚铁，絮凝率为82.42%，之后则为氯化钠、氯化钾、硫酸镁，絮凝率分别为70.11%、63.62%、62.31%。之后废水中添加KH2PO4，图1F表明随着KH2PO4含量的增加，复合菌产絮凝剂的絮凝率逐渐升高，添加至0.4g/100mL时，絮凝效果最佳，达到92.33%，之后开始下降，由此显示KH2PO4投加量的最佳范围为0.3～0.5g/100mL。

作为培养基的马铃薯淀粉废水初始pH对复合菌产絮凝剂的絮凝率影响较大，图1G表明，在所考察范围内，复合菌最适宜的培养初始pH为7左右，当pH为7时絮凝率达最大值92.84%，而pH过高或过低均会影响微生物的生长和絮凝剂的产生，最适范围在 pH6～7。

2.1.2.2 正交设计实验优化营养条件 正交实验结果表4表明，对高岭土絮凝率影响的各因素主次顺序为A＞D＞B＞C，即影响最大是碳源乙醇，依次分别是pH、氮源NH4NO3和无机盐KH2PO4。方差分析表5可知，乙醇、NH4NO3、pH对絮凝率的影响均达到极显著水平，KH2PO4则影响不显著。不考虑交互作用，复合菌在废水中的最佳培养条件为A2B1C1D2，即乙醇 1.5mL/100mL、NH4NO30.15g/100mL、KH2PO40.35g/100mL、pH7.0。进一步对正交实验所得最佳营养条件进行验证，所得絮凝率达到96.44%，高于正交设计的各组实验。

表4 L9(34)实验结果Table 4 Result of L9(34)experiment

2.2 马铃薯淀粉废水中絮凝条件的优化

2.2.1 单因素对COD去除率的影响 由图2A可知，随着复合菌投加量增加，COD去除率出现由低—高—低的变化趋势，当产絮凝剂复合菌投放量为1mL/100mL时，去除率达最大值83.81%。当投放量大于1mL/100mL时，去除率降低，这是由于投药量加大时，废水中增加的聚合物将胶体微粒包裹，增加了胶体微粒的稳定性［20］。

废水pH对絮凝效果的影响如图2B所示，当pH在4～6之间时，COD去除率较好，均在85%以上，当废水的pH为5时，COD去除率达到最大值86.97%。此较佳pH范围也正是马铃薯淀粉废水的pH范围，因此在实际处理操作中无需添加酸或碱调节废水的pH，从而降低废水处理成本。

表5 营养条件优化的方差分析表Table 5 Variance analysis of nutrition conditions optimization

图2 单因素对COD去除率的影响Fig.2 Effects of single factors on COD removal rate

图2C和图2D表明，当添加废水培养的絮凝复合菌，及 300μL 1mol/L NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl3、AlCl3溶液后，COD 去除效果较好的是CaCl2、MgCl2，COD 去除率均达到 70% 以上，其中CaCl2助凝效果最佳，去除率达到72.64%，而其他种类的助凝剂都有一定得抑制作用。确定了助凝剂种类后，通过单因素实验，分别添加1%CaCl2溶液0.5、1、2、3、4、5mL/100mL，结果表明助凝剂 CaCl2随着投放量增加呈单峰型变化，当2mL/100mL时为COD去除率最佳，达到85.87%，之后去除率不断下降。

沉降时间对废水絮凝效果的影响，如图2E所示，复合菌所产絮凝剂具有良好的沉降性能，在沉降10min时COD去除率即可达到80%以上，当15min时，达到最大值81.85%，沉降20min后COD去除率减小，从处理成本考虑，本实验选择10min作为最佳时间。

由图2F可知，絮凝效果随着搅拌转速的增加而增加，当转速在 100～180r/min时，COD去除率从76.53%上升到88.03%，继续增加转速到220r/min时，去除率开始下降，当到达 300r/min时，降至72.31%。可能由于转速过大或者过小都会影响絮凝活性物质与大分子有机物质的充分接触和絮凝结合，最终影响COD去除效果。

2.2.2 响应面优化絮凝条件实验

2.2.2.1 响应面优化结果 实验设计了三因素三水平共17个实验点的响应面分析实验，共由12个析因点实验，及5个中心点实验组成，中心点实验重复5次，用以估计实验误差。响应面实验结果见表6。

2.2.2.2 模型的建立及方差检验 利用Design-Expert 8.0.6软件对表6中实验数据进行二次线性回归拟合，得到数学模型:

回归统计分析结果见表7。

由表7可看出，二次回归模型p＜0.0001极显著，因变量与所考察自变量之间的关系显著;复数相关系数R2=0.9848表明所建立的模型可以用来解释98.48%COD去除率的变化;失拟项p=0.9461＞0.05不显著，表明模型拟合程度较好，实验所得二次回归方程能很好地对马铃薯淀粉废水絮凝处理工艺进行分析和预测。同时可知，除了复合菌投加量和搅拌速度交互作用(AC)不显著(p＞0.05)外，搅拌速度、复合菌投加量和氯化钙投加量交互作用(AB)、氯化钙投加量和搅拌速度(BC)交互作用显著(p＜0.05)，其余项均对COD去除率有着极显著的影响，故各因素对COD去除率的影响不是简单的线性关系，对方程影响的显著程度依次是复合菌投加量＞氯化钙投加量＞搅拌速度。

表7 方差分析结果Table 7 Results of variance analysis

表6 响应面分析实验结果Table 6 Results of response surface design

2.2.2.3 絮凝条件响应面分析与优化 通过Design-Expert软件分析，得到响应面图，可直观反映各因素交互作用对响应值的影响，其中等高线的形状可反映出交互作用的强弱，椭圆形表示两两因素交互作用显著，圆形则与之相反。

由图3A所示，当搅拌速度一定时，随着复合菌投加量和CaCl2投加量的增加，COD去除率先增高后快速下降，表明若适当的同时增加复合菌投加量和CaCl2投加量时，可增大COD去除率;当复合菌投加量0.75～1mL/100mL，CaCl2投加量1～2mL/100mL 范围内，对COD去除率有增效作用，可提升废水处理效果。由表7和图3A可知，等高线椭圆，则复合菌和CaCl2投加量对去除率的交互作用显著。

图3B可知，当CaCl2投加量在一定条件下，复合菌投加量对COD去除率的影响呈先增大后减小趋势，搅拌速度对去除率则呈先增大后轻微减小趋势，当复合菌投加量1mL/100mL，搅拌速度180r/min时，COD去除率会达到最大值。等高线接近圆形，表明两因素在一定范围内交互作用不显著。

图3C表明，当复合菌投加量不变时，随着CaCl2投加量和搅拌速度增加，COD去除率先增大后缓慢减小;在 CaCl2投加量 1～2mL/100mL，搅拌速度140～180r/min范围内，去除率明显升高，在 CaCl2投加量2～3mL/100mL，搅拌速度 180～220r/min范围内，COD去除率缓慢减小。等高线为椭圆，两因素交互作用显著。

2.2.2.4 废水处理絮凝条件确定及验证 对二次回归方程求一阶偏导，得出马铃薯淀粉废水絮凝处理的最佳条件为:复合菌投加量0.98mL/100mL，CaCl2投加量2.08mL/100mL，搅拌速度186.83r/min，此条件下得到理论COD去除率预测值为88.82%。

对模型进行验证实验，将复合菌投加量修正为1mL/100mL，CaCl2投加量 2mL/100mL，搅拌速度为187r/min，得出马铃薯淀粉废水的 COD去除率为89.10%，与理论预测值88.82%较为接近，说明模型的拟合程度较好，回归方程的分析和预测可靠，可利用此工艺条件絮凝处理马铃薯淀粉废水。

2.3 絮凝效果分析

利用最佳工艺处理马铃薯淀粉废水，COD由8537mg/L下降至 931mg/L，COD去除率达到89.10%;浊度值由221mg/L下降至19mg/L，浊度去除率达到91.40%。

图3 多因素对COD去除率的响应面图Fig.3 Response surface showing the effects of three factors on COD removal rate

将处理后的废水过滤沉淀物，经干燥后称重，得粗蛋白物质6.23g/L，可作为动物蛋白饲料添加剂。

3 结论

通过单因素和正交实验，马铃薯淀粉废水培养絮凝复合菌的最优营养条件为乙醇1.5mL/100mL、NH4NO30.15g/100mL、KH2PO40.35g/100mL、pH7.0。

在单因素实验基础上，通过Box-Bahnken响应面分析实验，得到絮凝复合菌处理马铃薯淀粉废水工艺的最优条件为复合菌投加量1mL/100mL，CaCl2投加量2mL/100mL，搅拌速度187r/min，COD去除率理论预测值为88.82%，所处理马铃薯淀粉废水的COD去除率实际值为89.10%。

利用最优工艺处理马铃薯淀粉废水，COD降至931mg/L，COD去除率达到 89.10%;浊度值降至19mg/L，浊度去除率达到91.40%，同时得粗蛋白物质6.23g/L，可作为动物蛋白饲料添加剂。

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