结直肠癌组织KRAS和BRAF基因突变情况及意义

宋 敏，孙亚琼，张 莉，潘 琼

(郑州大学第一附属医院，郑州450052)

结直肠癌是三大常见的恶性肿瘤之一，多数患者就诊时已经处于晚期，失去了手术治疗的最佳机会。临床试验证明，西妥昔单抗、帕尼单抗等表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂治疗转移性结直肠癌的疗效较常规化疗显著提高，但只有KRAS野生型患者从中受益［1，2］。KRAS对抗 EGFR 治疗的预测作用已经明确，但其与临床特征、预后之间的关系无明确结论。而关于BRAF基因的研究相对较少，虽被报道与抗 EGFR 耐药相关［1，3］，但其突变状态与病情及预后的关系尚无定论。2010年1月～2013年12月，我们观察了结直肠癌组织KRAS和BRAF基因突变情况，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择结直肠癌组织477例，均经甲醛固定、石蜡包埋，患者均未行抗EGFR(西妥昔单抗/帕尼单抗)治疗。其中男295例，女182例;年龄27～81岁，平均51岁;结肠癌316例，直肠癌161例;具有分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移情况、浸润深度、TNM 分期等资料者分别为 473、209、373、366、362例。

1.2 方法

1.2.1 指标观察方法 记录肿瘤原发部位、大小、分化程度、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期，并随访至疾病进展或死亡，记录无进展生存期(PFS)。

1.2.2 基因突变检测 采用实时荧光PCR及多重PCR-STR法检测KRAS基因外显子2第12、13位密码子的基因突变情况，其中315例同时检测BRAF基因外显子15的突变情况，并对扩增产物进行测序。按照DNA试剂盒(QIAGEN)说明提取石蜡标本基因组DNA，KEAS上游引物:5'-GGTACTGGTGGAGTATTTGATAG-3'，下游引物:5'-TGGTCCTGCACCAGTAATATG-3'，扩增长度248 bp;BRAF上游引物:5'-CTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3'，下游引物:5'-GTGGAAAAATAGCCTCAATTCTT-3'，扩增长度211 bp。反应条件:初始变性95℃、5 min，95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共 45 个循环，72℃延伸10 min，4℃结束反应。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳确定后，采用ABI Sequence Analyzer测序分析。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。率的比较采用χ2检验，PFS的比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KRAS、BRAF 基因突变情况 KRAS 基因突变率为24.5%(117/477)，其中单纯 G12D突变50例、G12V突变29例、G12A突变11例、G13D突变17例、G13A突变9例，G12D联合G12V突变1例。BRAF基因突变率为11.4%(36/315)，均为V600E突变。未检测到同时发生KRAS与BRAF基因突变者，BRAF基因在KRAS基因野生型患者中的突变率为 14.2%(36/252)，KRAS基因在BRAR基因野生型患者中的突变率为22.6%(63/279)。

2.2 KRAS、BRAF基因突变与结直肠癌临床因素的关系 左、右侧结肠癌患者KRAS基因突变率分别为13.3%、36.4%，P=0.05。KRAS 基因突变型和野生型分别有69.2%、30.0%出现肝转移(P＜0.01)，有 30.8%、32.5% 出现肺转移(P ＞ 0.05)。KRAS基因在≥65岁患者中的突变率高于＜65岁者，P＜0.01。BRAF基因在男性、高分化、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期的突变率分别高于女性、中低分化、Ⅰ～Ⅱ期，P 均 ＜0.05。

表1 KRAS、BRAF基因突变与结直肠癌患者临床因素的关系［例(%)］

2.3 KRAS、BRAF基因突变与PFS的关系 KRAS基因突变型的PFS为6.2个月，野生型为10.6个月，P＞0.05。BRAF基因突变型的PFS为10个月，野生型为8个月，P ＞0.05。

3 讨论

KRAS是大鼠肉瘤原癌基因家族(RAS)的成员之一，在抑制肿瘤细胞凋亡及加速其增殖方面起着重要的作用。BRAF通过激活MAPK通路和抑制促凋亡因子 BIM，导致细胞异常增殖和分化。当KRAS或BRAF基因发生突变时导致EGFR下游通路的激活，从而产生抗EGFR耐药。结合目前关于KRAS、BRAF基因突变状态的研究结果，虽然证实KRAS野生型患者能从抗EGFR治疗中获益，但仍有相当数量患者对抗EGFR治疗无效。KRAS基因状态并不能筛选出所有抗EGFR治疗有效人群，而BRAF基因突变检测目前均与KRAS基因检测同时进行，参考价值仍依赖于KRAS基因突变状态，尚不能单独作为预测因子。因此需要更有效、更多预测因子来确定更加精确地靶向治疗有效人群，目前已有 TP53、PTEN 与 PIK3CA、E-cadherin、NRAS 等相关因子的研究，但均未得出定论，希望更多的学者能在此研究方向得出更加精确的结论。

目前研究报道，KRAS突变率为20% ～45%［4～8］，BRAF 突变率为 4%～ 15%［9～15］，与本研究中KRAS(24.5%)和BRAF基因突变率(11.4%)基本一致。目前研究表明，KRAS、BRAF基因突变在女性、高级别肿瘤、右侧肿瘤、老年患者中多见，并有报道显示二者突变率在结肠癌中明显高于直肠癌［8］。而本研究显示，KRAS基因突变与老年显著相关，BRAF基因突变则在男性中多见，以上差异可能是由于地域性、研究样本量和基因检测方法不同等导致的。此前报道中未曾发现KRAS基因同时多个密码子突变，因此认为KRAS基因各密码子突变为独立事件。而本研究中观察到1例KRAS基因同时发生G12D、G12V密码子突变，可能系检测误差所致，但亦不能排除KRAS基因存在多种密码子突变形式共存的可能性，有待后续观察证实。本研究分析KRAS、BRAF基因突变状态与患者预后之间的关系，认为基因突变患者肝转移率较高;但未发现基因突变与PFS之间存在明显关联，表明KRAS与BRAF基因状态并不能预测以奥沙利铂/伊立替康为基础治疗的疗效。

综上所述，KRAS基因突变与结直肠癌患者的年龄、发病部位及肝转移有关，BRAF基因突变与性别、分化程度、肿瘤TNM分期有关;检测两基因突变情况有助于判断结直肠癌患者的病情。由于本研究患者均未行抗EGFR治疗，所以未能观察到两基因突变对抗EGFR靶向治疗的预测作用及其对预后的影响，有待进一步研究。

［1］De Roock W，Claes B，Bernasconi D，et al.Effects of KRAS，BRAF，NRAS，and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer:a retrospective consortium analysis［J］.Lancet Oncol，2010，11(8):753-762.

［2］Van Cutsem E，Köhne CH，Hitre E，et al.Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer［J］.N Engl J Med，2009，360(14):1408-1417.

［3］ Ling Y，Ying JM，Qiu T，et al.Detection of KRAS，BRAF，PIK3CA and EGFR gene mutations in colorectal carcinoma［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2012，41(9):590-594.

［4］Bokemeyer C，Van Cutsem E，Rougier P，et al.Addition of cetuximab to chemotherapy as first-line treatment for KRAS wild-type metastatic colorectal cancer:pooled analysis of the CRYSTAL and OPUS randomised clinical trials［J］.Eur J Cancer，2012，48(10):1466-1475.

［5］ Bokemeyer C，Bondarenko I，Makhson A，et al.Fluorouracil，leucovorin，and oxaliplatin with and without cetuximab in the firstline treatment of metastaticcolorectal cancer［J］.J Clin Oncol，2009，27(5):663-671.

［6］Tveit KM，Guren T，Glimelius B，et al.PhaseⅢ trial of cetuximab with continuous or intermittent fluorouracil，leucovorin，and oxaliplatin(Nordic FLOX)versus FLOX alone in first-line treatment of metastatic colorectal cancer:the NORDIC-VⅡ study［J］.J Clin Oncol，2012，30(15):1755-1762.

［7］Maughan TS，Adams RA，Smith CG，et al.Addition of cetuximab to oxaliplatin-based first-line combination chemotherapy for treatment of advanced colorectal cancer:results of the randomised phase 3 MRC COIN trial［J］.Lancet，2011，377(9783):2103-2114.

［8］高静，孙志伟，李艳艳，等.中国结直肠癌患者966例中KRAS和BRAF基因突变分析［J］.中华病理学杂志，2012，41(9):579-583.

［9］朱晓丽，蔡旭，张玲，等.中国结直肠癌患者中KRAS与BRAF基因突变特征及其临床病理相关性［J］.中华病理学杂志，2012，41(9):584-589.

［10］Zhu XL，Cai X，Zhang L，et al.KRAS and BRAF gene mutations in correlation with clinicopathologic features of colorectal carcinoma in Chinese［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2012，41(9):584-589.

［11］Van Cutsem E，Köhne CH，Láng I，et al.Cetuximab plus irinotecan，flourouracil and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer:updated analysis of overall survival according to tumor KRAS and BRAF mutation status［J］.J Clin Oncol，2011，29(15):2011-2019.

［12］Gao J，Wang TT，Yu JW，et al.Wild-Type KRAS and BRAF Could Predict Response to Cetuximab in Chinese Colorectal Cancer Patients［J］.Chin J Cancer Res，2011，23(4):271-275.

［13］De Roock W，Claes B，Bernasconi D，et al.Effects of KRAS BRAF NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer:a retrospective consortium analysis［J］.Lancet Oncol，2010，11(8):753-762.

［14］Di Nicolantonio F，Martini M，Molinari F，et al.Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer［J］.J Clin Oncol，2008，26(35):5705-5712.

［15］Samowitz WS，Sweeney C，Herrick C，et al.Poor survival associated with the BRAF V600E mutation in microsatellite-stable colon cancers［J］.Cancer Res，2005，65(14):6063-6069.