芍药苷预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织细胞凋亡及CHOP蛋白表达的影响

毛森林，马翊竑，张海东，齐 军，李 峰

(哈尔滨医科大学附属第二医院，哈尔滨150086)

脑缺血/再灌注损伤(CIR)最终会导致神经元 凋亡［1］，凋亡的通路主要有死亡受体活化途径(外源性途径)、线粒体损伤途径(内源性途径)和内质网应激启动的凋亡途径，其中内质网应激途径(ERS)是目前发现的一种新的凋亡途径［2，3］。有研究显示，ERS在CIR过程中处于核心地位，预处理可以减轻组织损伤［4，5］，而上调 CHOP 蛋白表达是ERS诱导细胞神经元凋亡的途径之一。有研究报道，芍药苷(PA)不仅具有降低血黏度、抗血小板聚集、抗炎、免疫抑制及抗肿瘤等作用［6～9］，还对 CIR有一定的保护功能［10］。2014年1～3月，我们观察了PA预处理对CIR大鼠组织细胞凋亡及CHOP蛋白表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SD雄性大鼠72只，体质量(250±10)g，均来自哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心。水合氯醛购于 Sigma公司，DMSO购于美国Amresco公司，冰冻切片快速抗原修复液购于碧云天生物技术研究所，DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于德国Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 分组预处理与造模 将72只SD雄性大鼠随机分为预处理组、模型组、假手术组各24只。预处理组给予0.2 mg/kg PA灌胃，模型组及假手术组给予等量PBS灌胃，1次/d，连续3 d。于给药后第4天，参照Longa等［11］的方法并加以改良，建立大鼠CIA模型。造模前禁食12 h，不禁水。预处理组、模型组根据体质量腹腔注射水合氯醛0.3 mL/100 g，固定、备皮;后颈前正中旁开2 mm做纵行小切口，分离左侧颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)及颈总动脉(CCA)。结扎ECA远端，分别在ICA及CCA上放置显微血管夹，在ECA距CCA分叉部约7 mm处剪一斜行小切口，将线栓自ECA切口插入;用电凝器将剪口处电凝处理，切断ECA，分别松开ICA及CCA上显微动脉夹;调转线栓头端方向，将线栓在直视下插入ICA约17 mm，从而阻断大脑中动脉(MCA)主干血流;将大鼠切口处用纱布蘸取少量生理盐水覆盖，保留线栓90 min后拔出，缝合切口。假手术组仅暴露各动脉，不做切口与线栓插入。在模型制作过程中，凡手术中动物死亡、蛛网膜下腔出血或无对侧偏瘫体征均视为模型制作失败，用同一批次的大鼠造模成功后补足数目。

1.2.2 脑组织细胞凋亡检测 采用TUNEL法。各组分别于再灌注1(T0)、4(T1)、24(T2)h各取6只大鼠快速断头取脑，制作脑组织冰冻切片，片厚7 μm。4%多聚甲醛固定，PBS洗涤、孵育，加50 μL生物素标记液，37℃孵育60 min;加0.1～0.3 mL标记反应终止液，室温孵育10 min;加50 μL Streptavidin-HRP工作液，湿盒室温孵育30 min;加0.2～0.5 mL DAB显色液，室温孵育;常规乙醇脱水，二甲苯透明后封片。细胞核或细胞质染成棕黄色颗粒者为阳性细胞，即为凋亡细胞。于200倍显微镜下随机选取6个视野，每个视野采用IPP6.0软件计数凋亡细胞。细胞凋亡指数=凋亡细胞/细胞总数×100%，取平均值。

1.2.3 脑组织CHOP蛋白检测 采用免疫组化法。切片经4%PFA固定20 min，30%H2O2和纯甲醇以1∶50的比例固定30 min，抗原修复液修复5 min，5%BSA封闭 30 min。加 CHOP抗体(兔 IgG 1∶100)4℃过夜，及生物素化山羊抗兔IgG(1∶200)37℃孵育20 min。SABC封闭30 min后DAB显色，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，树胶封片。以PBS代替CHOP抗体作为对照，细胞核及细胞质呈棕黄色为阳性表达。显微镜下每张切片随机选取6个视野进行观察拍照，使用IPP6.0软件进行细胞计数。CHOP蛋白表达=阳性细胞数/细胞总数×100%。1.2.4 神经功能评分 每组于缺血再灌注后24 h各取6只大鼠，由不知分组情况的观察者在相同条件下参照Bederson等［12］的方法进行神经功能评分:0分:正常，未见任何神经功能缺损表现;1分:垂直提起时缺血对侧前爪不能伸直;2分:行走时向偏瘫侧转圈;3分:行走时身体向偏瘫侧倾倒;4分:不能自发行走或有意识障碍。评分为0、4分者剔除实验。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组内比较采用配对t检验，组间数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脑组织细胞凋亡指数和CHOP蛋白表达比较 见表1。

2.2 各组神经功能评分比较 预处理组神经功能评分为(1.33 ±0.52)分，模型组(2.50 ±1.05)分，假手术组为0分;预处理组和模型组的神经功能评分均高于与假手术组，P分别 ＜0.05、0.01;预处理组和模型组比较，P ＜0.01。

3 讨论

缺血性脑卒中是由各种原因所致急性脑动脉血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性坏死，出现相应神经功能损害的综合征［13］;是严重威胁人类健康的疾病之一，具有高发病率、高致残率、高复发率的特点。正常生理状态下，流经脑组织的血液为750～1 000 mL/min，为心脏每搏输出量的1/5，脑组织耗氧量占全身耗氧量的20%～30%，脑细胞的主要能量来源为有氧代谢产生的葡萄糖，几乎没有能量储备，因此脑组织对缺血、缺氧性损害十分敏感。如果脑动脉血流持续中断10～15 min，神经元就会发生不可逆性损害而坏死［14］。因此，在CIR超急性期采取积极的治疗措施恢复血供尤为重要。溶栓治疗可以实现闭塞脑动脉再通，重建脑血流，使受损脑组织的血液重新再灌注，从而挽救缺血半暗带，迅速恢复受损伤的神经功能，被认为是最有效的脑卒中治疗方法［15］。而溶栓治疗除有出血的并发症外，再灌注损伤对脑细胞的损害也不可忽视。

表1 各组脑组织细胞凋亡指数和CHOP蛋白表达比较(%，±s)

表1 各组脑组织细胞凋亡指数和CHOP蛋白表达比较(%，±s)

注:与假手术组同时点比较，*P＜0.01;与模型组同时点比较，#P ＜0.05;与同组T0时点比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与同组 T1时比较，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01

组别 细胞凋亡指数 CHOP蛋白0.3 ±0.2预处理组T0 4.1 ±0.3*# 3.7 ±0.8*#T1 5.2 ±1.2*# 4.2 ±1.3*#T2 18.5 ±4.3*#△△☆☆ 12.7 ±1.2*#△☆模型组T0 9.3 ±0.2* 9.8 ±2.1*T1 10.6 ±2.5* 11.3 ±1.2*T2 29.5 ±2.6＊△△☆☆ 27.3 ±1.4＊△△☆假手术组T0 0 0.2 ±0.1 T1 0 0.2 ±0.1 T20

ERS主要通过以下3种方式诱导细胞神经元凋亡:①CHOP基因激活ATF4转录因子持续表达促使编码细胞凋亡的诱导因子，上调 CHOP表达;CHOP可诱导氧自由基，促使细胞凋亡。②JNK激活途径激活JNK诱导细胞凋亡。③ Caspase-12激活通路激活IRE后，激活Caspase-9、Caspase-3导致细胞凋亡。本研究采用PA对CIR大鼠进行预处理后发现，同时点脑组织细胞凋亡指数、CHOP蛋白表达比较，模型组 ＞预处理组 ＞假手术组，P均 ＜0.05;预处理组和模型组脑组织细胞凋亡指数、CHOP蛋白表达在缺血再灌注初期表达量很少，均于再灌注24 h达到峰值;且预处理组和模型组的神经功能评分均高于对照组。不仅说明缺血再灌注过程中CHOP蛋白表达的上调启动了ERS，还证明了PA对于CIR大鼠的神经细胞具有保护作用，可以拮抗CHOP的表达，维持细胞的稳态，阻断ERS诱导的细胞凋亡，进而减轻神经细胞的凋亡。

综上所述，PA预处理可以显著降低CIR大鼠脑组织细胞凋亡、CHOP蛋白表达及神经功能评分，可能与阻断ERS引发的细胞凋亡有关。但是由于CIR机制很复杂，有诸多的环节共同作用，而且本研究以大鼠作为研究对象，和人体有很大的差异，所以PA预处理是否能在临床上具有相同的效果仍有待于进一步研究。

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