人脐带间充质干细胞对百草枯中毒肺损伤小鼠模型的治疗作用

吕双红 ，王慧娜，杜丽欣，宋亚昆，吴东颖，刘兵，邱泽武

军事医学科学院 附属医院 a.肿瘤学研究室；b.307-青藤转化医学中心；c.中毒救治科；北京 100071

百草枯（paraquat，PQ）是一种广泛使用的高效除草剂,对人有较强的毒性作用。由于其中毒致死量小、无特效解毒剂、常规对症治疗效果极差，故死亡率居高不下。百草枯中毒的特征性改变是肺损伤，早期表现为肺泡上皮细胞受损，肺泡内出血水肿，晚期则表现为肺泡内和肺间质纤维化。

近年来，随着干细胞研究的进展，干细胞在临床难治性和顽固性疾病治疗方面的应用研究越来越多。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）因取材方便、再生能力强、细胞增殖快、操作简单等优点而广受青睐。已有研究[1]显示，MSC可被募集到肺损伤部位，分化并修复肺泡上皮细胞，增加表面活性物质分泌，减轻炎症反应，具有治疗肺损伤的巨大潜力。在本研究中，我们探讨了脐带来源间充质干细胞（umbilical cord MSC，UCMSC）治疗百草枯中毒性肺损伤的可行性，旨在为百草枯中毒的临床治疗开拓新的途径。

1 材料与方法

1.1 UCMSC的分离、培养、鉴定

UCMSC 取自空军总医院健康剖腹产胎儿，经知情同意，无感染性疾病。将脐带样品冲洗干净，剪成2～3 mm3的小块，加入1%胶原酶消化液于37℃消化2 h，用70 μm 筛网过滤，收集上清，离心收集细胞；用PBS 清洗后，加入5 mL 培养液重悬细胞，37℃、5% CO2培养箱中培养，待80%～90%汇合时，按1∶2或1∶3 的比例传代。动物体内移植采用6～8 代细胞。采用流式细胞仪检测MSC表面标志的表达。

1.2 百草枯中毒性肺损伤模型的制备

健康成年雄性C57BL/6 小鼠（8 周龄，20～22 g）购自北京华阜康生物科技公司，在军事医学科学院实验动物中心饲养，于屏障环境内活动，室内恒温恒湿，人工照明12 h/d，自由进食、水。动物适应性饲养1 周后一次性腹腔注射百草枯溶液，注射液体量为0.2 mL/10 g。急性肺损伤动物模型于造模后7 d处死，肺纤维化模型于造模后21 d处死。

1.3 动物分组

105 只小鼠，根据百草枯给药剂量（40、50、60 mg/kg）及是否输注UCMSC 进行治疗分为6 组：40 mg/kg-PBS 组（n=30）；40 mg/kg-UCMSC 组（n=29）；50 mg/kg-PBS 组（n=13）；50 mg/kg-UCMSC 组（n=13）；60 mg/kg-PBS 组（n=10）；60 mg/kg-UCMSC 组（n=10）。PBS 组于百草枯造模后24 h 尾静脉注射PBS；UCMSC 组于造模后24 h 尾静脉输注UCMSC。其中40 mg/kg-PBS 组和40 mg/kg-UCMSC 组各取14 只于21 d 处死，观察UCMSC 对百草枯诱导肺纤维化的治疗作用；其余动物于7 d处死，观察UCMSC对急性肺损伤的治疗作用。记录死亡率和体重变化，并取肺组织进行病理包埋和切片，病理评分。

1.4 肺组织病理切片染色及评分

肺组织切片经常规HE染色，按急性肺损伤或肺纤维化评分标准进行评分。急性肺损伤评分标准参照文献[2]，病理评分范围为0～16 分。肺纤维化评分标准采用Ashcroft 的方法[3]。若每一视野内正常组织结构占主导（＞50%），则予评0 分；若每一显微视野内肺纤维化病变占主导（＞50%），则其具体分级标准如表1。若评分级别在2个奇数得分之间时，则取其中间值。

1.5 PCR检测UCMSC植入

8 只40 mg/kg 百草枯染毒动物，分别于UCMSC移植后3 h、24 h、7 d 取肺组织，提取基因组DNA，RT-PCR 检测人特异性线粒体基因chrome B mitochondria（CBM）的表达情况。所用引物为Forward（5'CATGGTGAAACCCCGTCTCTA3'）和Reverse（5'GCCTCAGCCTCCCGAGTAG3'）。扩增条件：94℃5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，30个循环。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 UCMSC 移植对百草枯中毒性急性肺损伤的治疗作用

动物给予不同剂量百草枯腹腔注射造模，24 h后尾静脉输注UCMSC 治疗。结果显示，UCMSC 治疗可提高较低剂量（40、50 mg/kg）百草枯中毒动物的生存率，剂量过高（60 mg/kg）时UCMSC 对动物的生存率并没有改善，表明过高的百草枯引起的肺损伤过程可能已处于不可逆的状态。但肺组织病理评分没有统计学差异，这可能是由于病理的改变需要一定的时间。

2.2 UCMSC 对百草枯中毒诱导的肺纤维化的治疗作用

腹腔注射40 mg/kg 百草枯溶液后小鼠体重明显下降，到第5 d 下降到最低值，随后缓慢恢复，但UCMSC 尾静脉注射治疗组动物的体重恢复较早较快。生存率曲线显示，UCMSC 治疗后动物的生存率提高（图2）。

表1 肺组织纤维化分级标准

表2 UCMSC对急性百草枯中毒小鼠死亡率的影响

表3 小鼠急性肺损伤病理评分

百草枯染毒后21 d 肺组织有充血及出血，肺泡壁增厚，部分闭塞，血管及支气管周围可见纤维细胞增殖及胶原沉积，严重时可观察到肺结构明显破坏，纤维块或纤维束形成。UCMSC 治疗组肺组织纤维化程度减轻（图3），Ashcroft 病理评分显著降低（表4）。这些结果表明，UCMSC 治疗百草枯中毒诱导的纤维化可取得一定的疗效。

2.3 PCR检测UCMSC植入结果

RT-PCR 结果显示，在UCMSC 移植后3 h 的肺组织中有人特异性CBM基因表达，但24 h后未检测到，表明移植细胞在肺内可能无植入。

3 讨论

图1 小鼠急性百草枯中毒性肺损伤HE染色

图2 UCMSC对小鼠百草枯中毒性肺纤维化的治疗作用

表4 UCMSC治疗百草枯诱导肺纤维化小鼠的死亡率及病理评分

百草枯是一种有较强毒性的除草剂，由于肺部细胞对其有主动摄取和蓄积作用，使得肺受损最为严重，临床尚无特效解毒药物，因此患者病死率极高。血液灌流是当前治疗百草枯中毒的有效方法，但其对百草枯所造成的肺损伤临床疗效极为有限。

MSC 最初在骨髓中被发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，日益受到人们的关注。研究证实[1]，UCMSC 移植后能够植入损伤肺部，进一步分化为肺上皮细胞，并通过减少促炎症细胞因子、升高抗炎症细胞因子、减轻肺水肿等途径，对肺损伤起到一定的治疗作用。研究表明[4]，与MSC 共培养可减少肺Ⅱ型上皮细胞对百草枯的蓄积量，上调抗氧化基因的表达，有利于上皮细胞的存活。将骨髓MSC 植入百草枯染毒大鼠后，减轻了模型动物的肺损伤[5-7]。但骨髓源MSC 受患者年龄、体质等因素的限制，且具有创伤性；而UCMSC 来源广泛，便于取材，对供者无不利影响，无伦理道德问题的限制，且细胞增殖、分化能力较强，适合体外大规模培养，因此，已成为骨髓MSC 的理想替代来源。但UCMSC 用于百草枯中毒性肺损伤的研究仅有个别报道。

已有动物实验研究[8]表明UCMSC 对脂多糖（LPS）引起的急性肺损伤具有治疗作用。国内也有临床应用UCMSC 治疗百草枯中毒病例的报道[9]，发现治疗后病人死亡率降低。但目前尚无UCMSC 治疗百草枯肺损伤的动物实验研究，也没有证据表明UCMSC 治疗百草枯肺损伤有明确疗效。在本研究中我们发现，采用UCMCS 治疗百草枯中毒性急性肺损伤，在较低剂量百草枯中毒模型中可提高动物的生存率，但百草枯剂量过高时UCMSC 对动物生存率并没有改善，表明过高的百草枯引起的肺损伤过程已处于不可逆状态。低剂量百草枯中毒模型中UCMSC 虽能改善生存率，肺组织病理评分仍没有统计学差异，这可能是由于病理的改变需要一定的时间。有鉴于此，临床应用UCMSC 治疗急性百草枯中毒时，需要选择合适的病例。

图3 UCMSC治疗小鼠百草枯中毒性肺纤维化HE染色

图4 人特异性CBM基因的RT-PCR检测结果

Yamashita[10]对存活的百草枯中毒患者进行随访发现，即使是轻微的肺损伤，仍可引起患者在较长时间内的限制性肺功能损伤，最终导致不可逆的肺间质纤维化，而一旦出现肺间质纤维化，病人预后极差，目前尚无确切有效的救治手段。Moodley 等[11]的研究表明，UCMSC 可减轻博莱霉素诱导的肺纤维化。另有研究[12]表明，骨髓MSC 可减轻百草枯中毒大鼠肺纤维化的程度。本研究证实，UCMSC 对百草枯诱导的肺纤维化有较好的治疗作用，动物体重恢复较早，存活率提高，肺纤维化评分显著降低。这一结果为未来使用UCMSC 治疗临床百草枯中毒病人的肺纤维化提供了理论依据。

目前认为，MSC 发挥治疗作用的主要机理是其旁分泌作用[13]。因为在很多移植研究中都发现，即使MSC 治疗有效，在移植部位也只能检测到很少或甚至不能检测到移植细胞。越来越多的研究表明，各种来源的MSC 均可分泌多种生物活性因子，以旁分泌的方式对靶细胞发挥抗疤痕形成、抗炎、抗凋亡等作用。本研究中，我们在移植后3 h 的肺组织中可检测到人特异性基因，但24 h 后未检测到，这表明UCMSC起作用的方式可能也是通过旁分泌途径。

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