慢病毒载体介导的层黏连蛋白受体稳定抑制细胞株的建立

武瑞琴，朱旭东，周晓巍，黄培堂

军事医学科学院a.生物工程研究所；b.疾病预防控制所；北京 100071

层黏连蛋白受体（laminin receptor，LR）又称层黏连蛋白结合蛋白（laminin binding protein，LBP），是细胞表面的跨膜糖蛋白，最早由Terranova 等[1]从人类乳腺癌细胞表面分离得到。已发现多种LR，根据其结构可分为整合素家族与非整合素家族两大类。其中，对非整合素家族中相对分子质量为67×103的LR（67kDa LR）的研究最为深入。67kDa LR通过疏水序列与层黏连蛋白的V 区/β1 链YIGSR 序列结合，广泛分布在上皮细胞、内皮细胞及大部分肿瘤细胞表面。层黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白等构成的基膜是构成肿瘤细胞转移的主要屏障，因此LR在肿瘤细胞黏附和迁移过程中发挥至关重要的作用[2]。慢病毒是一种导入外源基因的有效手段，通过介导外源基因整合到宿主染色体上，可实现外源基因在宿主中的稳定持续表达。此外，慢病毒的感染效率高，宿主细胞类型广泛，且不易诱发宿主免疫反应，安全性好，在基因的功能性研究中具有明显优势[3]。本研究的目的，是以慢病毒为载体，构建LR 表达稳定抑制的HeLa 细胞株，为深入探讨LR 在肿瘤转移中的作用机制提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa 细胞、293FT 细胞、慢病毒载体质粒pLenti6/v5-EGFP、质粒pUC-H1、兔抗LR 多克隆抗体均由本实验室保存；包装载体质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG 购自Invitrogen 公司；引物及小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）序列由北京奥科生物技术有限公司合成；Pfu高保真DNA 聚合酶购自上海生物工程有限公司；各种限制性内切酶购自NEB公司；T4DNA连接酶、DNA质粒提取试剂盒、质粒大提试剂盒Maxipreps DNA purification System 购自Promega 公司；胶回收试剂盒购自Qiagen 公司；细胞培养基DMEM 和Opti-MEM 购自Invitrogen 公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司；羊抗α-actinin、HRP 标记的兔抗羊IgG 购自Santa Cruz Biotechnology 公司；HRP 标记的抗兔IgG 购自Amersham Pharmacia Biotech公司。

1.2 H1启动子的插入

从pUC-H1 载体中PCR 获得H1 启动子，末端加入ClaⅠ位点，同时在H1启动子下游末端ClaⅠ位点之前引入NheⅠ和PacⅠ限制性内切酶位点。扩增H1 的引物为H1-sense（5'-AATTGGATCGATCCATGGAATTCGAACGCTGACG-3'）和H1-antisense（5'-AATTGGATATTTAATTAAGCTAGCGTGGTCTCAATACAGAACTTA-3'）。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒对H1 条带进行回收纯化；用ClaⅠ酶切pLenti6/v5-EGFP 载体，经琼脂糖凝胶电泳分离回收酶切产物；将上述回收产物用T4DNA 连接酶连接得到pLenti6/v5-EGFP-H1，转化大肠杆菌JM109 感受态细胞，于含氨苄西林的LB 平板上于37℃倒置培养过夜；菌落PCR筛选阳性克隆，将阳性克隆接种于含氨苄西林的LB 培养液中，37℃振荡培养过夜，送华诺公司测序。

1.3 LR靶向shRNA序列的设计

根据NCBI 中LR 的基因序列和Ambion 公司的pSolencer 说明书设计2条shRNA（表1），由北京奥科生物公司合成。

1.4 LR靶向shRNA序列的插入

将合成的shRNA 序列退火，使其形成双链DNA；分别用PacⅠ和NheⅠ双酶切shRNA 双链和pLenti6/v5-EGFP-H1载体，1%琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，经T4DNA 连接酶连接得到pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA；将上述载体转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化细菌接种到含氨苄西林的LB平板上，于37℃倒置培养过夜；利用H1 上游引物和引物6、7 下游序列（引物6 antisense：5'-TTAATTAATTC CAAAAACCTTCACT-3'；引 物7 antisense：5'-TTA ATTAATTCCAAAAATAACAAGG-3'）进行菌落PCR筛选阳性克隆。

1.5 慢病毒的包装和感染

将pLenti6/v5-EGFP-H1-LRshRNA 载体质粒和包装质粒共转染细胞汇合度达到90%的293FT 细胞，以pLenti6/v5-EGFP-H1 为阳性对照。转染后4 h 换成新鲜的DMEM 培养基（含10% FBS，1 mmol/L丙酮酸钠，0.1 mmol/L 非必需氨基酸），转染后72 h收获并浓缩病毒，4℃、3000 r/min 离心15 min，取上清，加入终浓度为5×10-4g/L 的聚合赖氨酸（PLL），轻轻混匀，4℃孵育30 min，4℃、10 000 r/min 离心2 h，用DMEM重悬，分装后于-70℃保存。

HeLa 细胞用DMEM 培养液（含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）于37℃、5% CO2条件下培养，感染前1 d 铺至24 孔板。分别以含有LR-sh6、LR-sh7 及空白对照的病毒感染细胞，感染后48～72 h可在荧光显微镜下观察细胞内的荧光。

1.6 稳定细胞株的筛选

病毒感染后的HeLa细胞于第4 d加入4 μg/mL的杀稻瘟菌素（blasticidin），每隔3 d换一次抗生素，共筛选12 d。筛选后的细胞经胰酶消化后在显微镜下计数，用新鲜培养基稀释后铺96 孔板，保证每孔仅含1 个细胞，于37℃、5% CO2条件下培养，待长出细胞克隆后在荧光显微镜下观察，发出绿色荧光的克隆即为阳性细胞克隆。扩大培养后，最终获得阳性慢病毒感染的HeLa细胞系，即HeLa-LR-sh6和HeLa-LR-sh7。

1.7 real-time PCR 检 测HeLa 细胞中LR 的mRNA表达水平

将HeLa 细胞和稳定表达shRNA 的HeLa-LR 细胞株铺至24 孔板，于37℃、5% CO2条件下培养48 h后提取总RNA。取0.5 μg 总RNA 为模板，以Oligo（dT）为引物进行反转录获得cDNA。将cDNA 稀释后作为模板，加入DNA 缓冲液、上下游引物、dNTP和Taqman 探针，进行real-time PCR，根据所得数据计算LR mRNA的表达水平。

1.8 Western 印迹检测HeLa 细胞中LR 的蛋白表达水平

用NP-40 细胞裂解液裂解已感染病毒的细胞，4℃、12 000 r/min 离心10 min 收集上清，测定蛋白浓度后取一定量的蛋白样品进行SDS-PAGE 分离蛋白，转印至PVDF 膜，用TBST 配制的5%脱脂奶粉室温封闭1 h，LR 兔抗和α-actinin 羊抗稀释后室温孵育1 h，二抗稀释后室温反应1 h，加发光液后显色，检测LR蛋白的表达水平。

2 结果

2.1 H1启动子的扩增和插入

以pUC-H1 质粒为模板扩增H1 启动子，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示得到260 bp 的片段（图1）。将扩增片段插入pLenti6/v5-EGFP 载体，对连接转化的菌落进行PCR 鉴定，得到多个阳性克隆（图2）。挑选2、6、9、12 这4 个阳性克隆测序，结果表明插入的H1 启动子序列正确（序列略）。

2.2 pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA的构建

将合成的单链shRNA 序列的正反链缓慢退火形成双链，与经NheⅠ和PacⅠ双酶切的pLenti6/v5-EGFP-H1 载体连接，用H1 启动子上游引物和合成的LR-sh6 和LR-sh7 下游引物对连接转化的菌落进行PCR 鉴定（图3），表明shRNA 片段连入pLenti6/v5-EGFP-H1，构建成pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA载体，测序结果表明插入的外源序列正确（序列略）。

2.3 稳定表达LR 靶向shRNA 的HeLa 细胞株的获得

图1 H1启动子PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

图2 菌落PCR筛选阳性pLenti6/v5-EGFP-H1重组子

用构建的pLenti6/v5-EGFP-H1-LR-sh6 和pLenti6/v5-EGFP-H1-LR-sh7 慢病毒载体包装病毒后感染HeLa 细胞，筛选得到稳定表达LR shRNA 的2 组共34 株HeLa-LR-sh6 和HeLa-LR-sh7 细胞，荧光显微镜下几乎全部细胞均发出绿色荧光（图4）。

2.4 HeLa-LR-shRNA 细胞株中LR的抑制效果

对2组共34株细胞培养2 d后提取总RNA和蛋白，进行real-time PCR 和Western 印迹，分别在转录水平和蛋白水平检测HeLa细胞中LR 的表达。realtime PCR 结果显示34 株细胞中有14 株LR 的表达受到明显抑制，LR-sh6 和LR-sh7 在RNA 水平上都表现出了较好的LR 抑制作用，LR-sh7 的抑制效率最高可达90%（图5）。Western 印迹显示稳定表达shRNA的细胞中LR的蛋白水平明显下降（图6、7）。

3 讨论

层黏连蛋白是重要的细胞外基质成分。大量研究表明，LR 参与多种细胞活动，不仅能够介导病毒和朊蛋白与宿主细胞的相互作用[4-5]，而且与肿瘤细胞的转移密切相关，通过信号转导介导细胞之间的识别和组织细胞的衰老过程。

图3 菌落PCR筛选pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA阳性重组子

图4 稳定表达LR靶向shRNA的HeLa细胞株

图5 LR shRNA的抑制效率

图6 HeLa-LR-sh6细胞LR蛋白的表达

图7 HeLa-LR-sh7细胞LR蛋白的表达

研究表明，LR 的表达水平与很多肿瘤特别是上皮细胞肿瘤的恶性程度有关。在卵巢癌、肺癌及结肠癌中都发现LR 的表达与肿瘤的发展阶段呈正相关。Yow 等[6]的研究结果显示，结肠癌中LR mRNA水平比邻近的正常结肠上皮细胞高出近9 倍。在乳腺癌[7]、肝癌[8]中，LR 的高表达增强了肿瘤的局部浸润和淋巴结转移能力。Berno等[9]针对乳腺癌细胞转移的研究表明，LR 可通过调控肌动蛋白组装，影响细胞的黏附和迁移，同时伴随蛋白水解酶的活化。Horwitz等的研究结果则显示，LR与细胞外基质相互作用影响肿瘤细胞的信号转导，可引起ERK、JNK 和p38MAPK的活化，从而影响肿瘤细胞的转移。

为了深入研究LR在肿瘤转移中的作用机制，我们设计了靶向LR 的shRNA，并构建了慢病毒载体。慢病毒载体可将shRNA 整合到宿主细胞的基因组中，通过筛选获得了稳定表达shRNA 的HeLa 细胞，检测发现内源性LR 在转录和蛋白水平的表达被沉默，而且抑制效果显著。此细胞模型的建立，为体外研究LR 的生物学功能，尤其是LR 在肿瘤转移中的作用机制提供了有力的实验工具。

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