人VHL 基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的抑制

李玲 ，王婷，梁迎春，张立，冯滢滢，周丽英，冀全博，郭靖，徐小洁，叶棋浓

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.陕西省妇幼保健院 辅助生殖中心，陕西 西安 710003；3.总参警卫局 卫生保健处，北京 100017

von Hippel-Lindau（VHL）病是临床十分罕见的家族性常染色体显性遗传性肿瘤病，包括中枢神经系统血管母细胞瘤、嗜铬细胞瘤、散发性肾透明细胞癌等[1-2]。1993 年，Latif 等将VHL基因定位于染色体3p25-26，并首次克隆了该基因[3]。VHL基因为抑癌基因，该基因的失活会导致正常VHL 蛋白合成障碍，这与肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺导管癌等肿瘤的发生发展有着密切关系[4-6]。例如，VHLE3 泛素连接酶复合物能诱导癌细胞G1 期停止,减少周期蛋白D1 及雌激素受体（ER）的表达，抑制雌激素依赖型乳腺癌细胞增殖[5]。

本实验拟构建带Myc 标签的VHL真核表达载体，以肝癌和乳腺癌2种细胞系进行VHL功能验证，为进一步研究VHL 在肿瘤发生发展中的关系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌ZR75-1 细胞系、人肝癌HepG2 细胞系、人胚肾293T 细胞系由本室传代培养；人乳腺文库、pXJ-40-myc 载体为本室保存；PCR 试剂、限制性内切酶、DNA 连接酶购自TaKaRa 公司；质粒提取、胶回收试剂盒购自Promega 公司；VigoFect 为威格拉斯生物技术有限公司产品；胎牛血清、DMEM 购自Gibco 公司。引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成；测序由北京博迈德科技发展有限公司完成。

1.2 myc-VHL重组质粒的构建与测序

以人乳腺文库为模板，根据GenBank 中的人源VHL序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATGCCCC GGAGGGCGGAGAA-3'）和下游引物（5'-CCGCTC GAGTCAATCTCCCATCCGTTGATGTG-3'），PCR 法扩增人VHL的编码序列（扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃再延长7 min）。

将PCR 产物行12 g/L 琼脂糖凝胶电泳，若条带特异且位置正确，则胶回收PCR 产物后用BamHⅠ/XhoⅠ酶切，形成带粘性末端的双链；BamHⅠ/XhoⅠ双酶切pXJ-40-myc 载体，胶回收载体的大片段；将PCR 产物酶切片段用T4DNA 连接酶连接入pXJ-40-myc载体，转化大肠杆菌DH5α感受态后，挑克隆进行菌液PCR，选取阳性克隆培养并提取质粒，再用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定；将酶切鉴定正确的克隆送北京博迈德科技发展有限公司测序。

1.3 转染人胚肾293T细胞和Western印迹检测

用含1%双抗及10%胎牛血清的DMEM 培养基将人胚肾293T细胞接种于2个6 cm 皿中，接种量以转染时70%～80%的细胞密度为宜，转染前1 h换液；将4μL VigoFect 与200μL NaCl 混 合，静 置5 min，期间将10μg 重组质粒与200μL NaCl 混合，然后将上述2 种溶液混匀，室温静置15 min 后加入6 cm 皿中；以同种方法转染pXJ-40-myc 载体作为对照。37℃、5% CO2常规培养，4～6 h 后换液；24 h后收细胞，3000 r/min 离心5 min，弃上清，加入2 倍细胞量的RIPA，于冰上裂解30 min，再加入等量2×SDS 上样缓冲液，沸水煮15 min，12 000 r/min 离心2 min后取上清液进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于4℃封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉以1∶5000 稀释的用HRP 标记的抗myc标签鼠单克隆抗体，室温下轻摇1 h，用1×TBST 洗膜3次，每次5 min；用化学发光法显色10 min，压片显影。

1.4 生长曲线实验

用pXJ-40-myc、5 及10μg 的myc-VHL 质粒分别转染ZR75-1、HepG2 细胞，24 h 后各以每孔3000个细胞的密度接种于5 块96 孔板，每组设3 个复孔，分别在第0、1、2、3、4 d 加入10μL CCK8 后37℃孵育1 h，测定D450nm值，以培养时间为横轴、D450nm平均值为纵轴绘制生长曲线。另收集铺种96 孔板后剩余的细胞进行Western印迹，检测VHL的表达量。

2 结果

2.1 myc-VHL重组质粒的构建与鉴定

以本室保存的人乳腺文库为模板，PCR 扩增人VHL的编码序列，获得长约650 bp 的DNA 片段，与预期大小一致（图1）。将BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后的PCR 产物和pXJ-40-myc 载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑克隆后进行菌液PCR 鉴定，若获得与目的条带650 bp 大小接近（图2）的克隆，则初步认为是带有人VHL基因的阳性重组克隆。将所得阳性克隆提质粒，经酶切鉴定，可切出2 条长度分别约为5000和650 bp的条带，且相应的空载体酶切后只见大片段，符合预期结果（图3）。DNA 序列测定结果表明，插入的DNA 序列与人VHL基因的编码序列完全一致（数据略）。

图1 PCR扩增人VHL的编码序列

图2 重组质粒pmyc-VHL的菌液PCR结果电泳图谱

2.2 Western 印迹检测myc-VHL 在293T 细胞中的表达

将构建的pmyc-VHL 重组质粒和空载体分别转染293T 细胞系，24 h 后提取蛋白进行SDS-PAGE，Western 印迹检测myc-VHL 蛋白的表达。结果显示，转染重组质粒后，用myc-HRP 抗体可在相对分子质量约26×103处检测到明显的特异性条带，而空载体无条带（图4）。

2.3 CCK8法验证myc-VHL抑制肿瘤细胞系的生长

VHL为抑癌基因，我们用5、10μg 量的pmyc-VHL 真核表达载体及pXJ-40-myc 载体转染乳腺癌ZR75-1、肝癌HepG2 细胞系（图5），通过CCK8 法进行生长曲线实验。结果显示，myc-VHL 能抑制ZR75-1和HepG2 细胞的生长，且转染剂量愈大，其对肿瘤细胞的抑制作用愈明显（图6）。

3 讨论

图3 重组质粒myc-VHL的BamHⅠ/XhoⅠ双酶切电泳图谱

图4 Western印迹检测融合蛋白的表达

图5 不同剂量myc-VHL在乳腺癌ZR75-1细胞和肝癌HepG2细胞中的表达

图6 VHL抑制肿瘤细胞生长

VHL基因是抑癌基因，具有典型肿瘤抑制基因的特征，通过多种途径抑制肿瘤的形成。其产物VHL与Wnt信号通路、缺氧诱导因子、氧化磷酸化的调控有关。研究表明，VHL通过参与形成E3泛素连接酶复合体并与低氧诱导因子（HIF-α）结合[7-9]；VHL基因失活时VHL 不能正常表达，导致HIF 的含量增加，从而使得GLUT-1、VEGF、EPO、TGF-α等细胞因子表达，这些细胞因子广泛参与细胞内的能量代谢、血管生长、细胞周期、细胞凋亡等生理过程，与肿瘤的发生发展密切相关[10-11]。

目前对于VHL基因的结构与功能及其调控途径的研究已取得重要进展，已明确VHL基因的失活机制主要包括基因突变、杂合性缺失和甲基化，通过对VHL基因失活机制的研究，有助于筛选用于肿瘤早期诊断与预后的新分子标志物。如Volker 等[12]发现肝脏VHL基因缺失后肝组织严重变性；Kong 等[13]发现miRNA-155 通过靶向VHL促进肿瘤血管生成，并与三阴性乳腺癌不良预后相关。但目前的VHL研究还不够全面，例如上调VHL基因表达是否能够预防和治疗肿瘤，还有待于对其更深入的探讨。

综上所述，我们构建的myc-VHL 重组质粒在真核细胞中获得表达，能够抑制肿瘤细胞系如乳腺癌、肝癌细胞系的生长[4,14]。该重组质粒的构建，为后续研究VHL 的抑癌机制，以及从分子水平了解肿瘤的发生发展相关机制奠定了基础，有助于为肿瘤的早期诊断和特异性治疗开辟新的途径。

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