IL-27 p28基因多态性与中国汉族人群类风湿性关节炎的相关性研究①

陈 爽 张庆镐 方 芳(吉林医药学院免疫学教研室，吉林 132013)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性疾病。其多呈渐进型发展，若不及时治疗，易造成不可逆转的关节畸形和强直，致残率较高。RA的发病原因尚不明确，环境和遗传因素在疾病的发生和发展过程中起共同作用。普遍认为类风湿是一种自身免疫性疾病，在病人血清中可出现多种自身抗体，如类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP抗体)、抗体周因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)等。在发病的各种因素中，遗传因素占50%～60%，现已发现的与类风湿关节炎发病相关的易感基因包括HLA-DR、PADI4和PTPN22［1-6］等。易感基因的研究有助于阐明RA的发病机制，并可能成为其预防、治疗和预后控制的重要指标。

IL-27是2002年发现并命名的IL-6/IL-12家族成员，在抗感染抗肿瘤免疫和自身免疫性炎症等多方面免疫反应中起重要作用。目前发现它与多种炎性疾病与自身免疫病密切相关，2007年韩国学者分析发现IL-27p28基因启动子区域内的964A＞G位点多态性与韩国人群哮喘易感性有关［7］。2009年有报道白介素27多态性与韩国人炎症性肠病有关［8］。在我国，IL-27p28的-964 G等位基因携带可能与鼻咽癌病情严重程度有关［9］，IL-27基因-964A/G多态性与大肠癌的发病具有相关性［10］。IL-27与慢性乙肝病毒感染感染存在一定的相关性，A等位基因可能是HBV易感的遗传因素［11］。为明确对于中国汉族人群IL-27p28基因多态性是否有可能与自身免疫性疾病类风湿性关节炎存在着相关性，本实验提取了103名RA患者及104名正常人的全血样本的基因组DNA，所用样本均来自中国东北地区没有血缘关系的人群。采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片段，单碱基延伸进行目的基因分型，利用病例对照方法对所检测位点进行分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象 病例组103例，其中男28例，女75例，平均年龄40岁(年龄40～76岁)，病程6个月～15年，所选个体均为汉族人群来自吉林市人民医院和延边大学附属医院，诊断依据按美国风湿病协会1987年类风湿性关节炎诊断标准［12］，临床资料包括:起病年龄、关节肿胀和压痛数、畸形关节数、晨僵时间以及X线检查和生化检查指标(红细胞沉降率ESR，，类风湿因子RF，抗CCP抗体)。健康对照组104例，男43例，女61例，平均年龄57岁(年龄35～71岁)，选自延边大学附属医院体检的人群经过血清检测RF为阴性，并且无类风湿性关节炎的症状和体征表现，无自身免疫病家族史，排除感染、肿瘤等疾病。两组人群性别、年龄均无显著性差异(P＞0.05)。

1.2 方法 采集外周静脉血5 ml EDTA抗凝。取2 ml样本按照外周血基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化公司RelaxGene Blood DNA System，目录号DP319-01)说明书提取基因组DNA。DNA样本分装后置-20℃保存备用。引物根据Gene Bank上找到的IL-27的基因序列(NC-000016.9)，用软件primer5.0设计用于扩增的包含启动子区g.964A＞G和外显子区g.2905T＞G、g.4730T＞C的3对引物(由北京益百尚生物技术公司合成)。g.964A＞G引物序列为5'-CCTCTACAGAGCAGAAACACCA-3'(上游引物)，5'-GGCTCTGTCTCCATCTTTAACC-3'(下游引物)，扩增片段的产物长度377 bp;g.2905T＞G引物序列为5'-CTGGTTCAAGCTGGTGTCTG-3'(上游引物)，5'-CAGCCTTATCCAGGTTCTATCC-3'(下游引物)，扩增片段的产物长度443 bp;g.4730T＞C引物序列5'-GACCTTTCCTGACCATCTCC-3'(上游引物)，5'-ACTCATACAGACCCACATGCAC-3'(下游引物)，扩增片段的产物长度489bp。PCR扩增反应体系:DNA模板 1 μl，上下游引物各 1 μl，Mix 试剂 10 μl，加灭菌去离子水补足至终体积50 μl。反应条件为94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s，60℃退火 1 min，72℃延伸45 s，每个循环温度递减0.5℃，共10个循环;94℃变性 30 s，65℃退火1 min，72℃延伸45 s，共30个循环;72℃延伸3 min，4℃终止反应。PCR反应试剂盒购自北京鼎国吕盛生物技术公司(通用型PCR试剂盒)。取PCR产物1 μl加缓冲液0.5×TBE，1.0%琼脂糖凝胶电泳30 min，GoldView染色观察结果，分析PCR扩增情况。

1.3 统计学分析 PCR产物纯化后应用BigDye Terminator v3.1试剂盒，在ABI3730自动测序仪上测序(由益百尚生物技术公司完成)。基因型及等位基因频率用直接记数法计算。检验Hardy-weinberg平衡吻合度(HWE)统计三个多态位点在病例组和对照组中预期的基因型频率，确定所选各组人群是否可以代表中国汉族群体。应用SPSS17.0软件包采用χ2检验进行差异性比较，检测IL-27p28的-964A/G、2905T/G、g.4730T/C三个位点的基因型频率与等位基因频率在病例组及对照组中是否存在显著性差异，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR产物扩增 IL-27p28的三个位点分别应用相对应的3对引物进行扩增。在凝胶成像分析仪下成像，所得PCR产物大小与预期的产物一致(图1)。

2.2 PCR产物的测序结果 对IL-27基因g.964A＞G、g.2905T＞G和g.4730T＞C三个位点的PCR产物进行正向测序。启动子区-964位点存在二态性，在人群中可表现为AA纯合型、GG纯合型、GA杂合型(图2)。第二外显子2905位点也存在二态性，可表现为TT纯合型，GG纯合型，TG杂合型，其碱基变化T颠换位G，导致编码氨基酸由丝氨酸(Ser)变为丙氨酸(Alt)(图3)。第四外显子区4730表型仅为TT纯合型和TC杂合型，其中T转换为C导致编码的亮氨酸(Leu)转变为脯氨酸(Pro)。

2.3 RA组与对照组IL-27p28的连锁不平衡性和SNPs与类风湿性关节炎的相关性分析 对103名类风湿性关节炎患者和104名正常人进行检测。三个多态位点均符合Hardy-weinberg遗传平衡定律P＞0.05，证明所收集样本可以代表群体。组间基因型及等位基因的比较运用SPSS17.0进行统计，结果三个位点的基因型及等位基因频率的分布在正常对照组和病例组之间的分布均无显著性差异(表1)。

图1 IL-27基因g.2905位点PCR产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis result of PCR products on g.2905 site of IL-27 gene

图2 IL-27p28基因-964A＞G位点PCR产物测序图(GG纯合型)Fig.2 Sequencing map of IL-27p28(-964A ＞ G)gene PCR products(AG homozygous)

图3 IL-27p28基因2905T＞G位点PCR产物测序图(TG杂合型)Fig.3 Sequencing map of IL-27p28(2905T ＞ G)gene PCR products(TG heterozygous)

图4 IL-27p28基因g.4730T＞C位点PCR产物测序图(TC杂合型)Fig.4 Sequencing map of IL-27p28(4730T ＞ C)gene PCR products(TC heterozygous)

表1 病例组与对照组基因型及等位基因频率Tab.1 Genotype and allele frequencies in case and control groups

3 讨论

白介素 27(Interleukin-27，IL-27)是 2002年Pflanz等发现并命名的一种新型IL-12家族细胞因子，对不同类型免疫细胞具有重要调控作用，尤其在调节CD4+T细胞分化与增殖方面具有重要作用［13］。IL-27能协同IL-12促进初始CD4+T细胞产生IFN-γ，并促进 Th0 细胞向 Th1 细胞分化［14，15］;同时，IL-27还具有抑制效应Th2细胞功能的作用［16］。而在类风湿关节炎发病机制中CD4+T细胞(Th1/Th0细胞)起重要作用，类风湿性关节炎患者的Th1成持续性活化的高反应状态。并且已发现IL-27的增加有利于减轻和缓解关节炎［17］。因此，IL-27很有可能成为较好的治疗类风湿性关节炎的细胞因子。

对于诱因不明的自身免疫性疾病类风湿性关节炎现已发现有许多易感基因，而IL-27基因多态性也已发现出与许多自身免疫病密切相关，所以本研究考虑IL-27基因多态性会不会与类风湿性关节炎的易感性相关?本实验选取2007年韩国学者筛选的IL-27p28基因的4个单核苷酸多态(single nucleotide poly-morphism，SNP)位点中的 3个位点-964A ＞G、2905T＞G、g.4730T＞C，对其多态性进行研究，通过病例-对照组研究对IL-27基因单核苷酸多态位点进行分析。结果并未检测到3个多态位点与中国汉族人群类风湿性关节炎显著相关。

分析原因，一方面病例组和对照组的数量相对较少，另一方面收集的样本均为汉族人群，而基因多态性与种族、地域等多方面因素均有关联。IL-27的基因多态性虽然有可能与类风湿关节炎的易感性无显著关联，但IL-27的血清学变化对类风湿性关节炎的的调控和缓解是有显著的作用的［17，18］，因此IL-27p28很有可能成为治疗类风湿性关节炎的新的靶向因子。

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