系统性红斑狼疮患者血清中Tim-1蛋白水平及其基因多态性①

陈 杰 胡 娜 苏斌涛 崔天盆(武汉市第一医院检验科，武汉 430022)

人T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim)只有3个基因，分别为Tim-1、Tim-3和Tim-4，定位于染色体的5q33.2区域［1］。Tim-1能调节T细胞的增殖，增强 Th2型细胞因子的产生［2］，从而调节Th1/Th2反应;Tim-1还可促进凋亡细胞清除以及调节B调节免疫细胞功能。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)就是一种自身免疫性疾病，SLE患者Tim-1的mRNA表达水平增高并与疾病的活动程度相关［3］。Kobayashi等［4］在 2007 年报道Tim-1通过磷脂酰丝氨酸结合凋亡的细胞介导凋亡细胞的清除，而 SLE患者存在明显的凋亡紊乱［5］。Tim-1分子第157氨基酸残基的位置有六个氨基酸插入的突变157insMTTTVP，即第四外显子有18个核苷酸的插入。有该突变的个体在感染甲型肝炎病毒后不易患过敏性疾病［6］。SLE与过敏性疾病一样是一种免疫功能紊乱性疾病。因此，本文将探讨Tim-1第4外显子插入与缺失多态性及其血清水平与SLE发病的关系，推测Tim-1在SLE发病中的分子机制。

1 材料与方法

1.1 对象 系统性红斑狼疮患者92例，女性85人，男性7人。平均年龄41.9岁，范围从18岁到81岁。全部来自武汉市第一医院就诊患者，都符合美国风湿病学会(ACR)2009年的系统性红斑狼疮诊断标准。正常对照来自健康体检者。女性76人，男性5人，平均年龄42.3岁，范围从20岁到75岁。没有自身免疫性疾病病史。

1.2 方法

1.2.1 血清的收集 收集受检者静脉血3 ml，离心，取血清，-80℃保存备用

1.2.2 Tim-1蛋白的ELISA检测 ELISA试剂购自R＆D公司。共检测健康对照者中26例，SLE患者中47例。鼠抗人的Tim-1蛋白单克隆抗体用0.05 mol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3包被缓冲液稀释至终浓度为 1 μg/ml，空白 96 孔板，每孔加 100 μl，室温过夜;弃包被抗体，每孔加封闭液(5%BSA-PBS)100 μl，室温放置 1 h;弃封闭液，用 1%的 Tween20的PBS洗板三次，一次5 min;加入血清和系列稀释的标准品100 μl，室温放置1 h;重复上面洗板步骤;加入稀释至工作浓度的生物素化的兔抗人的Tim-1蛋白的多克隆抗体100 μl，室温放置1 h;重复上面洗板步骤;加入1∶5 000稀释的链霉亲和素-HRP结合物，室温放置1 h;重复上面洗板步骤;加入显色试剂TMB显色20 min，加入 H2SO4终止显色反应。450 nm测定OD值。绘制工作曲线，计算样本Tim-1蛋白浓度。

1.2.3 模板DNA的提取 使用血常规采血管收集受检者静脉血2 ml，离心，吸取白膜层细胞。用TIANGEN公司的DNA提取试剂盒(货号:DP304)提取基因组DNA，溶于TE中，-20℃保存备用。

1.2.4 TIM-1的第4外显子插入与缺失多态性分析 自行设计一对引物，上游引物:5'-TCCAGCCTGAGGCTCCTTGTTT-3'，下游引物:5'-ATGCTCATTGTTGTTGGAACAG-3'。缺失型 PCR产物大小是201 bp，插入型是 219 bp。

PCR反应体系总体积为25 μl，模板 DNA 100 ng，上下游引物各 1 μl(终浓度为 0.4 pmol/μl)，PCR Marster mix(TIANGEN公司货号:KT201-02)12.5 μl，用双蒸水补足反应体系的体积。PCR反应条件:94℃ 预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 1 min，30 个循环。

PCR产物5 μl，用3%的含GoldviewⅠ琼脂糖凝胶电泳。伯乐凝胶成像分析仪(Bio-Rad chemiDocTMXRS+)进行拍照。缺失/缺失纯合子出现一条201 bp的条带，缺失/插入杂合子出现201 bp和219 bp的两个条带，插入/插入纯合子只出现219 bp的一个条带。

1.3 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行统计分析，计量资料以表示，组间比较采用独立样本的t检验。如果方差不齐，采用两独立样本的Wilcoxon秩和检验。基因型和等位基因频率经哈迪—温伯格平衡定律检验，基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 血清中Tim-1蛋白浓度 47例SLE患者和26例健康对照组血清中Tim-1蛋白浓度分别为(263.083±276.953)和(58.527±92.424)pg/ml。该资料方差不齐，采用秩和检验(Z=-4.93，P＜0.05)，两者之间差异具有统计学意义。Tim-1蛋白浓度在SLE患者中的水平高于健康对照组。

2.2 不同基因型个体血清中Tim-1蛋白浓度比较

SLE患者TIM-1的第4外显子缺失/缺失纯合子29例与缺失/插入杂合子18例的Tim-1蛋白的平均浓度分别为(307.360±284.079)和(191.750±256.708)pg/ml，两组之间无显著性差异(t=1.406，P=0.167)。健康对照组TIM-1的第4外显子缺失/缺失纯合子17例与缺失/插入杂合子8例的Tim-1蛋白的平均浓度分别为(70.295±109.917)和(40.468±41.739)pg/ml，两组之间无显著性差异(t=0.736，P=0.469)。因为插入/插入基因型的个体数较少，没有进行统计比较。该突变没有改变Tim-1蛋白在血清中的浓度。

表1 TIM-1外显子4ins/del基因型和等位基因频率Tab.1 The exon 4 of TIM-1 ins/del genotype and allele frequencies

图1 Tim-1第4外显子ins/del基因分析图Fig.1 Ins/del polymorphism of the exon 4 of Tim-1 analysis chart

2.2 基因分型结果图 缺失/缺失(del/del)纯合子出现一条201 bp的条带，缺失/插入(del/ins)杂合子出现201 bp和219 bp的两个条带，插入/插入(ins/ins)纯合子只出现219 bp的一个条带，见图1。

2.3 TIM-1基因的多态性与系统性红斑狼疮的关系的分析 对照组和系统性红斑狼疮组中，缺失/缺失纯合子出现最多，缺失/插入杂合子次之，插入/插入纯合子出现最少。经HWE平衡检验，符合哈迪-温伯格平衡定律，表明该样本具有抽样代表性(χ2=0.060，P=0.806)。经卡方检验，三种基因型组间差别无统计学意义(χ2=1.723，P=0.437)。Tim-1此基因多态性与SLE无相关性，见表1。

3 讨论

人的 Tim基因有三个成员:Tim-1、Tim-3和Tim-4。Tim-3和Tim-1表达于T细胞表面。Tim-3特异性的表达在Th1型细胞上，负性调节Th1细胞反应。Tim-4表达于抗原提呈细胞，是Tim-1的配体。Tim-4与 Tim-1相互作用，调节T细胞的活化增殖［2］。Tim-1是甲型肝炎病毒的受体［7］，T 细胞活化共刺激分子。Tim-1分子第157氨基酸残基的位置有6个氨基酸插入的突变157insMTTTVP，即第四外显子有18个核苷酸的插入。有该突变的个体在感染甲型肝炎病毒后不易患过敏性疾病［6］。因此，Tim-1可能参与了免疫系统的调控，该突变可能改变其功能。

SLE是一种多因素的自身免疫性疾病。机体会出现多种自身抗体，补体活化和免疫复合物沉积，导致组织和多器官损伤。辅助性的T细胞主要分化成两型:Th1和Th2。Th1和Th2细胞功能的失衡在SLE的病理机制中起了重要作用［8］。Tim-1是活化T细胞的共刺激分子，大量表达于CD4+T细胞上，促进Th2型细胞介导的免疫反应［9］，因此参与Th1和Th2细胞功能平衡的调节。SLE会产生许多抗核成分的自身抗体，特别是抗染色质的自身抗体。由于凋亡的发生异常或者凋亡细胞的清除异常，含有染色质的凋亡碎片被释放。在凋亡的过程中，这些染色质被修饰过，因此增加了自身的免疫原性。树突状细胞吞噬这些碎片，活化自身反应性的T辅助性细胞，接着活化自身反应性的B细胞，产生自身抗体。被修饰过的染色质与这些自身抗体结合形成复合物，沉积在基底膜上，引起炎症。因此，凋亡细胞清除障碍是SLE的一个病因［5］。Tim-1可以结合磷脂酰丝氨酸，促进凋亡细胞的清除［10］。国外Xiao等［11］制作一个Tim-1分子粘蛋白结构域缺失的基因敲除的小鼠，这种突变型的小鼠表现出调节性B细胞分泌IL-10缺陷，这种小鼠随着年龄的增长会自发系统性自身免疫性疾病，血清中INF-γ和自身抗体的量增加，因此，Tim-1在维持调节性B细胞的负性免疫调节功能中起很重要的作用［11］。

本实验中，检测92例SLE患者，81位健康对照个体，没有发现Tim-1的第4外显子插入/缺失多态性与SLE的相关性。同时比较不同基因型个体血清中Tim-1蛋白浓度，发现该突变不影响血清中其蛋白浓度。这可能是Tim-1此种基因多态性与SLE无相关性的原因。47个SLE患者和26个健康对照组血清中Tim-1蛋白平均浓度分别为263.083±276.953和58.527±92.424 pg/ml，其差异具有统计学意义。与Wang［3］等报道SLE患者外周淋巴细胞表达Tim-1 mRNA水平增加相对应，我们发现SLE患者血清中Tim-1蛋白浓度是高于健康对照组的。适量的Tim-1蛋白结合磷脂酰丝氨酸，促进凋亡细胞的清除［4］。SLE患者存在凋亡紊乱，SLE外周血淋巴细胞凋亡增加，且凋亡细胞与正常细胞比例与SLE活动度呈正比;凋亡细胞是核小体的重要来源，而核小体与核小体抗体的结合，核小体与硫酸软骨素的结合是导致狼疮肾炎的病理生理基础［5］，肾Tim-1表达水平高，我们推测SLE患者凋亡细胞增加，反馈刺激Tim-1表达增加，导致血清Tim-1蛋白的升高;最近Xiao［11］等研究发现Tim-1是调节性B细胞的表面标记之一，SLE患者血清异常增高的Tim-1可能竞争性干扰调节性B细胞的功能，导致SLE病理进程加速。

总之，Tim-1蛋白在系统性红斑狼疮患者血清中的浓度升高，可能干扰凋亡清除或/和调节性B细胞的功能，可能与系统性红斑狼疮的病理生理机制有关。有关具体机制有待随后的研究进一步证实。

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