携带tPA信号肽序列HuZP3核心抗原核酸疫苗质粒的构建与体外瞬时表达①

郭 焱 瞿新明 崔健丽 吴泽民 李春莉 金宁一

(长春中医药大学基础医学院，长春130117)

理想的透明带疫苗应该能诱发足够的抗体反应而不激活病理性的T细胞反应，即能够诱发足够滴度的抗透明带抗体并产生明显的避孕效果而又不至于引起卵巢自身免疫疾病，因此制备只含有ZP3 B细胞表位而不带人T细胞表位的肽段，对制备透明带疫苗至关重要。本实验按编码23～360肽段的人ZP3基因序列，从人ZP3cDNA扩增出只含人透明带B细胞表位而不带人T细胞表位DNA序列，并在此序列前插入tPA信号肽基因，构建真核表达质粒pIRESI-tPA/ZP3，以此作为核酸疫苗。

1 材料与方法

1.1 材料 pGEM-T、pIRESIneo质粒，DL-2000 Marker购自Promega公司，DH5α等由本实验室提供。各种限制性内切酶、DMEM细胞培养液和胎牛血清购自美国 Gibco公司;DNA连接酶购自美国Promega公司;DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Axygen公司、质粒小量提取试剂盒购自 Genscript公司。引物合成及测序由大连宝生物公司完成，

1.2 方法

1.2.1 PCR合成ZP3 B、tPA细胞表位肽基因 以cDNA为模板，用特异引物扩增ZP3B表位基因片段。首先依据GenBank中ZP3的mRNA的序列设计合成一对引物:上游引物:5'-GAATTC CAACCCCTCTGGCTCTTGCAGGGT-3'含 EcoRⅠ酶切位点;下游引物:5'-CTCGAGGGAAGCAGACCTGGACCA-3'含XhoⅠ酶切位点。

根据 GenBank(序列号 E00896)上公布的，tPA的序列，利用在线信号肽分析工具预测tPA信号肽，设计1对能互为模板直接进行扩增的特异性引物，通过重叠PCR的方法扩增tPA信号肽。上游引物:5'-ACAGCTAGCATGGATGCAATGAAGAGAGGG ctctgctgtgtgctgctgctgtgtgg-3'。下游引物:5'-TTTGGATCCGCTGGGCGAAACGAAGACTGCTccacacagcagcagcacacagcagag-3'。并分别在5'端引入 EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切位点及保护性碱基。PCR合成ZP3 B细胞表位肽基因和tPA信号肽基因。

1.2.2 重组质粒pIRESI-tPA/ZP3的构建与鉴定分别将tPA信号肽基因与ZP3 B表位基因BamHⅠ酶切，回收酶切片段，经 T4 DNA连接酶连接，16℃反应过夜。以tPA信号肽基因与ZP3 B细胞表位基因的连接产物为模板，设计引物扩增目的基因，将胶回收的目的DNA双酶切后连入相同酶切真核表达载体pIRESIneo，连接产物再转化大肠杆菌E.coli DH5α，菌落PCR和酶切鉴定挑选阳性重组子进行测序，将测序正确的重组子命名为 pIRESI-tPA/ZP3。

1.2.3 核酸疫苗质粒的体外瞬时表达 CHO细胞株复苏后用含10%胎牛血清的含抗生素的DMEM培养液在37℃，5%CO2的条件下进行培养。转染前一天接入150 mm的培养皿中，待细胞丰度为70%时用脂质体法分别转染50 mg的 pIRESIneo、pIRESI-ZP3/tPA质粒，转染48 h后收集培养上清和细胞裂解液。分别将收获的20 ml培养上清用50 ml Millipore离心管分次离心(3 000 r/min，4℃)至培养上清浓缩到200 μl。

1.2.4 Western blot法检测HuZP3核心抗原的表达纯化产物经SDS-PAGE电泳分离后，转移至NC膜上，5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，加入抗 GST mAb，4℃ 孵育过夜。PBS-Tween20(PBST)洗膜 4次，每次10 min，再加入HRP标记的羊抗小鼠 IgG，37℃温育1 h，PBST和 PBS分别先后洗膜4次后，ECL化学发光显色，检测核酸疫苗质粒在真核细胞内表达及向细胞外分泌的情况。

1.2.5 核酸疫苗质粒免疫原性分析

1.2.5.1 多克隆抗体的制备 免疫前取尾静脉血分离血清，作为免疫前的血清对照。以核酸疫苗质粒免疫雌性BALB/c小鼠，采用颈前肌肌肉注射，2周后进行第1次加强免疫。之后每隔3周加强免疫1次，共免疫4次。于末次免疫1周后脱颈处死小鼠并眼眶取血。分离血清，进行纯化，制备IgG，分装置-20℃保存。

1.2.5.2 ELISA检测核酸疫苗质粒免疫活性 将本室纯化的ZP3蛋白用抗原稀释液稀释至200 ng/ml，并向每孔中加入100 μl，4℃包被过夜。封闭洗涤，加100 μl上述制备的多克隆抗体，在37℃温育2 h，加入 100 μl羊抗鼠 IgG-HRP(1∶3 000)37℃反应2 h，洗涤后加入底物显色10 min，终止反应后测定490 nm的OD值。

2 结果

2.1 PCR获取目的DNA序列 以带有人全长ZP3cDNA的质粒pcDNA3.1为模板进行PCR扩增的结果见图1，图中可见在约1 000 bp处有单一的特异扩增带，与预期目的基因片段的分子量(1 000 bp)相符。tPA信号肽基因PCR产物长度为90 bp，以100 bp梯度Marker作对照，PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳后，在预期位置出现清晰的目的基因条带。

2.2 重组质粒pIRESI-tPA/ZP3的构建与鉴定 将合成的tPA信号肽基因与ZP3 B细胞表位基因定向插入至同一pIRESIneo载体上(图2)，PCR鉴定可见特异性目的条带，同时分别用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。结果表明，所见DNA条带与理论值相符，DNA序列测定显示，与设计的已知序列均完全一致，无突变发生，表明ZP3/tPA被正确插入到载体，核酸疫苗质粒 pIRES1-ZP3/tPA构建成功 (图3)。

2.3 携带tPA分泌型核酸疫苗质粒的体外表达经过 Western blot的验证，证实了 pIRES1-ZP3/tPA在上清和细胞裂解液中均高于pIRES1neo(图4)。

图1 PCR扩增产物电泳图Fig．1 Amplication of product by PCR

图2 重组质粒pIRES1-ZP3/tPA的构建Fig．2 Construction of recombinant plasmid pIRES1-ZP3/tPA

2.4 免疫鼠抗血清效价检测 采用ELISA法检测免疫小鼠抗 ZP3抗体，结果见表 1。免疫 4次后，免疫鼠血清抗ZP3抗体效价明显高于免疫前的血清对照，说明构建的核酸疫苗质粒具有很好的免疫原性，可用于研制疫苗。

图3 pIRES1-ZP3/tPA酶切鉴定Fig．3 Identification of pIRES1-ZP3/tPA with EcoR Ⅰand BamHⅠ

图4 核酸疫苗ZP3/tPA靶抗原在CHO细胞中的表达Fig．4 Expression of target antigen ZP3/tPA encoded by nucleic acid vaccine in CHO cell line

表1 免疫鼠抗血清效价的检测(n=8)Tab．1 Detection of antiserum titer in mouse(n=8)

3 讨论

作为精子初级受体的ZP3具有很强的抗原性，在精卵结合过程中起着重要的作用。由于抗ZP3抗体可以阻断精卵的相互作用，ZP3已被认为是一种潜在的靶抗原而成为一种理想的不育疫苗[1]。

许多研究已经阐明抗ZP3抗体能够在灵长类包括人体内阻断受精，然而一些实验却观察到其对卵巢生理功能有不同程度的影响[2，3]。本实验在综合分析前人研究的基础上，设计和扩增了适合在哺乳动物细胞中表达人ZP3B细胞表位的DNA序列，删除有可能引起卵巢生理功能紊乱的T细胞表位的DNA序列。

组织纤溶酶原激活物(tPA)信号肽序含有一个KOZARK增强子，可有效促进异种蛋白的分泌，提高其诱导抗体产生的能力[4-6]。

核酸疫苗是近年发展的一种核酸介导的免疫接种疫苗，其本质是当含有病原体抗原基因的真核表达载体被导入机体后，可被机体细胞所摄取并表达病原体的抗原蛋白，从而诱发机体对该蛋白的免疫反应。随着导入途径和部位的不同可引发全身或局部的免疫反应。在全身性的免疫应答反应中，既可激活体液免疫，也可诱发细胞免疫[7-9]。

载体系统可分为病毒载体系统和非病毒载体系统，常用的病毒载体包括反转录病毒、腺病毒、慢病毒等;常用的非病毒载体有阳离子脂质体和分子耦联载体等。由于病毒载体可能有感染、致癌、免疫原性强、操作过程烦琐等缺点;实验选用非病毒载体系统的代表载体质粒pIRES1neo，转染过程操作简便，省时且经济，对细胞类型的运用面广，对转染的核酸类型和分子量有很高的包容性，对细胞毒性小，也可以用于体内的基因转染，因此以质粒作为载体在基因工程中得到了越来越广泛的应用[10]。

因此，研究中我们选择 pIRES1neo为载体，将tPA信号肽与ZP3 B细胞表位DNA序列插入其多克隆酶切位点，构建了只含人透明带ZP3B细胞表位的DNA序列的核酸疫苗质粒 pIRES1-ZP3/tPA。构建的核酸疫苗质粒pIRES1-ZP3/tPA，经酶切鉴定及测序表明，与设计的已知序列均完全一致，表明ZP3/tPA被正确插入到载体质粒中，核酸疫苗质粒pIRES1-ZP3/tPA构建成功。为验证靶基因是否表达，我们利用脂质体法转染细胞，采用免疫印迹法测定核酸疫苗质粒pIRES1-ZP3/tPA在体外CHO细胞中的表达以筛选具有高表达性的ZP3基因疫苗，并将其免疫实验小鼠，以酶联免疫吸附法验证其免疫原性，结果显示构建的核酸疫苗质粒pIRES1-ZP3/tPA具有很好的免疫原性，为后续核酸疫苗质粒的鉴定及新型避孕疫苗的研制奠定了基础。

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