NK细胞的发育分化与功能极化①

魏海明 田志刚

(中国科学技术大学免疫学研究所，合肥230027)

魏海明(1963年－)，中国科学技术大学生命科学学院教授、博士生导师，中国免疫学会理事、中国免疫学会基础免疫学专业委员会副主任委员，中国免疫学会肿瘤免疫与生物治疗专业委员会副主任委员，中国免疫学会英文会刊Cellular＆Molecular Immunology编辑部主任。主要从事天然免疫与肿瘤免疫研究，近五年来以通讯作者在PNAS、Nat Commun、Hepatology、Gastroenterology、PLoS Pathog、J Autoimmun、J Immunol等SCI收录的国外杂志发表论文16篇，以署名作者发表SCI论文55篇。

田志刚(1956年－)，中国科学技术大学生命科学学院教授、博士生导师，现任中国科技大学生命科学学院院长，免疫学研究所所长。中国免疫学会副理事长，中国免疫学会英文会刊(Cell Mol Immunol)执行主编。2001年国家杰出青年获得者、2007年教育部创新团队负责人、2008和2011年国家基金委《天然免疫与重大疾病发生发展》创新群体负责人。2008年国家自然科学二等奖(首位)、2011年国家科技进步二等奖(第二位)。主要从事天然免疫和肝脏免疫学研究，以通讯作者在 Immunity、J Clin Invest、J Exp Med、PNAS、Nature Commun、Gastroenterology、Hepatology、J Allergy Clin Immunol、PloS Pathogen、J Hepatol、J Immunol等SCI收录的国外杂志发表论文159篇，Web of Science他引2 415次，在美、德、加、日等国际会议或访问中作学术报告30余次。

近十年来，NK细胞的研究有两大重要进展，一是发现NK细胞的受体多样性，二是发现NK细胞的功能多样性［1，2］。NK细胞受体主要由两个基因复合体集中编码，分别是人第19号染色体上的白细胞受体复合体 (Leukocyte receptor complex，LRC)和第12号染色体上的NK细胞受体复合体(NK receptor complex，NKC)，至少编码10种以上抑制性受体和20种以上活化性受体、黏附分子和共刺激分子，NK细胞的这种受体多样性是生物多样性的微观体现，也是生物多样性的代表性范例，最终赋予NK细胞的功能多样性。NK细胞的专职功能一直被认为是抗病毒、杀肿瘤，但最近在多种组织或器官中发现不同比例的居留NK细胞，可以表现出多样性功能［3，4］，比如，肝脏 NK 细胞可能介导肝脏免疫耐受或免疫损伤，蜕膜NK细胞可能介导母胎免疫耐受或血管重铸，肿瘤浸润NK细胞(TINK)可能介导肿瘤免疫逃逸或直接杀伤。

NK细胞受体多样性和功能多样性的产生与NK细胞的发育分化密不可分，CD34+造血干细胞在向NK细胞发育分化过程中，通过生理微环境提供的 SCF、Flt3-L、IL-7、IL-15等多种细胞因子的作用，逐渐表达各种活化性受体与抑制性受体，进一步接受多种配体的作用，当机体出现病理变化，需要NK细胞发挥功能效应时，NK细胞向病理微环境定向趋化，在此进程中持续性、进行性获得局部炎性因子的触发和诱导，发生程序性分化和增殖，并最终极化为 NKtolerant、NKcytotoxic、NKregulatory等不同功能状态的NK细胞。以下就NK细胞的发育分化和功能极化过程及机制做初步概述。

1 NK细胞的发育分化过程初见端倪

NK细胞主要从造血干细胞(CD34+HSC)发育分化而来，其过程可分为三个阶段，以出现NK前体细胞(NKP)、未成熟NK细胞(iNK)和形成有功能的成熟NK细胞(mNK)为标志。整个过程依赖于骨髓基质微环境，因为后者可以提供NK发育分化必需的多种细胞因子。首先，在早期造血生长因子如FLT-3配基和c-kit配基(即干细胞因子SCF)等的作用下，CD34+HSC上调IL-2/IL-15Rβ(CD122)的表达，逐渐分化为CD34+CD122+CD56－NKP;这些前体细胞通过CD122分子获得对IL-15的应答能力。在骨髓微环境中IL-15主要由骨髓基质细胞产生，对NK细胞发育成熟起关键作用，最终可促进CD56 的表达，形成 CD3－CD56+NK 细胞［5］。

NK细胞还可以从淋巴结和扁桃体等次级淋巴组织(SLT)中发育成熟。其中主要是CD56brightNK细胞亚群，而CD56dimNK细胞可在淋巴结发育，但随输出淋巴管迁移出来，主要存在于外周血中。在SLT 中含有 CD34+CD45RA+α4β7+c-kit+CD2+CD7－CD62L+CD25+CD10－前体细胞，能够发育成为 CD56brightCD16dim/－NK 细胞［6］。在肠道的黏膜相关淋巴组织中也有CD34+CD45RA+NK前体细胞存在［7］，并伴随有大量能够产生IL-15的DC或其他APCs的存在。用抗体阻断CD56分子与成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1)的相互作用，能够明显抑制CD56brightNK细胞转化成CD56dimNK细胞，说明CD56分子对促进NK细胞的终末分化起到重要作用［8］。除了以上提到的骨髓、淋巴结和小肠等，NK细胞还可能会从肝脏、脾脏、胸腺(胸腺早期淋巴样前体细胞ELP也可分化发育成NK细胞)等环境中发育而来。

NK细胞在完成发育分化、履行自身功能之前，还要经历一个受教育(Educated)和被致敏(Primed)即获能的过程。先是NK以其抑制性受体与“实施教育”的同一个体(因而遗传背景相同)的正常细胞表面的MHCⅠ类分子相互识别，使之获得对自身细胞的免疫耐受，然后表达诸多能识别环境中细胞因子的受体，并接受相应细胞因子如IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和Ⅰ型干扰素的刺激，而成为能显示功能的致敏NK细胞(Primed NK)或特许NK细胞(Licensed NK)，当这些细胞与靶细胞相遇，即可通过整合抑制性和活化性信号，确定是否对靶细胞进行杀伤、耐受，还是进一步产生细胞因子发挥调节功能［9］。

2 NK细胞的功能亚群划分有所突破

根据CD56和CD16表达密度的不同，人NK细胞分成CD56brightCD16－NK细胞和CD56dimCD16+NK细胞两个亚群。CD56dimCD16+NK细胞主要存在于外周血，高水平表达CD16、杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (KIR)和LFA-1等分子，低表达CD94/NKG2A，仅表达不带α链的中亲和力IL-2受体(IL-2Rβγ)，以发挥杀伤功能为主，产生细胞因子的水平较低;而CD56brightCD16－NK细胞主要在次级淋巴组织中聚集，表达高亲和力IL-2受体 (IL-2Rαβγ)，CD94/NKG2A和L选择素 (CD62L)，低表达CD16和KIR，活化后以分泌细胞因子如 IFN-γ、TNF-β、IL-10、IL-13和GM-CSF等为主要功能，但细胞毒活性低。CD56dimCD16+NK细胞被认为是成熟NK细胞，可能从 CD56brightCD16－NK 细胞发育而来［10，11］。

由于小鼠NK细胞没有CD56同源物的表达，因此无法以此对人类和小鼠NK细胞的生物学功能进行比较。但是将CD27和CD11b分子联合起来，就可以将小鼠和人类NK细胞皆划分为CD11blowCD27low、CD11blowCD27high、CD11bhighCD27high和CD11bhighCD27low四个不同的亚群，这些NK细胞亚群处于发育分化的不同阶段，并且表型、功能、组织分布也各具特点。小鼠NK细胞在体内可能是沿着CD11blowCD27low→CD11blowCD27high→CD11bhighCD27high→ CD11bhighCD27low路径发育分化［12］。我们［13］通过分析蜕膜、脐血、外周血和肿瘤组织中的NK细胞，在人体内同样发现四个相应亚群的存在，即 CD11b－CD27－DN NK、CD27+SP NK、CD11b+CD27+DP NK和CD11b+SP NK，其中DN NK细胞类似初始NK细胞，有较高分化潜能，几乎缺乏分泌细胞因子及杀伤功能，CD27+SP NK细胞分泌细胞因子能力很强，CD11b+SP NK细胞杀伤功能很强。人蜕膜NK细胞(dNK)主要是CD27－CD11b－双阴性NK细胞 (DN)，外周血NK细胞(pNK)和脐血NK细胞(cNK)主要是CD11b+SP NK细胞，肿瘤浸润NK细胞(TINK)四亚群均出现。

3 NK细胞的功能极化现象较为普遍

如前所述，NK细胞的专职功能一直被认为是抗病毒、杀肿瘤，但近年来发现局部区域微环境可促使NK细胞在不同组织中向不同功能状态极化;也可能是外周循环的NK细胞在趋化因子的作用下迁移至局部组织中而展现出不同的表型和功能，近期的研究已获得不止于以下的结果。

①肝脏NK细胞。NK细胞约占肝脏浸润淋巴细胞的一半，表型主要为CD56lowCD16－，与循环系统中典型的CD56lowCD16+NK不同［14］。正常情况下，肝脏NK细胞居留在肝窦内，此处同样有大量枯否氏细胞，接受肠道共生菌释放的脂磷壁酸和脂多糖的刺激，分泌大量IL-10，后者可抑制NK细胞对IL-12和IL-18的应答能力，也可上调NKG2A的表达，使NK细胞处于耐受状态。嗜肝性病毒感染后，枯否氏细胞产生大量IL-6和IL-18，活化NK细胞，后者高表达TRAIL、穿孔素和粒酶等，既发挥抗病毒作用，也有可能介导肝脏损伤。

②子宫蜕膜层CD56highCD16－NK细胞。妊娠期间人类子宫蜕膜层出现一种特有的CD56highCD16－NK细胞亚群，同时表达CD9和CD103，高表达一种或多种KIR分子。尽管在这群细胞上也表达 NKp46、LFA-1、NKG2D、NKp44 等与杀伤相关的分子，但其细胞毒功能明显减弱。蜕膜NK细胞在表型及功能方面均不同于其他组织器官的NK细胞亚群，可能与孕期子宫局部微环境有关。这群NK细胞由外周血CD56hiCD16－NK细胞通过趋化因子如CXCR4等作用招募至子宫局部;亦可能是在子宫蜕膜局部发育分化而来，因为子宫蜕膜层中存在CD34+细胞，该细胞在体外适当的培养条件下能够发育分化为CD56hiCD16－NK细胞。我们发现，在妊娠初期蜕膜NK细胞表现为CD56brightCD27+，高分泌IFNγ，抑制由于胚胎与母体半基因不合或微生物感染而在局部形成的Th17细胞，维持母胎免疫耐受，是NK细胞调节功能的重要体现［15］。

③黏膜系统CD56+NKp44+NK细胞。开放的黏膜环境存在多种抗原刺激，是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线。在人和鼠的黏膜系统中存在一群 CD56+NKp44+的 NK细胞，该群细胞表达CCR6、CD96和CD103等多种向黏膜迁移的受体，此外还分泌CCR6的配体CCL20，不仅构成对自身向黏膜迁移的正反馈，也促进了其他免疫细胞向黏膜迁移。CD56+NKp44+NK细胞以分泌IL-22为主要功能，同时还能分泌IL-26、LIF等多种黏膜免疫相关细胞因子，但不分泌IL-17，因此这群细胞被命名为 NK-22［16］。NK-22细胞的标志初定为 CD56+CD127+RORγt+，其表型类似于不成熟NK细胞，主要表达NKp44、NKp30和NKp46，低表达颗粒酶 A和穿孔素，不表达 NKG2D、KIR2DL2-KIR2DL3和CD94，可能与维持肠道稳态密切相关。为了进一步规范NK细胞的命名与分类，最近提出天然淋巴细胞(innate lymphoid cells，ILCs)的概念，把经典的NK细胞和T-bet+的ILC称为ILC1，把ROR α+，分泌IL-5或IL-13的ILC称为 ILC2，把 ROR γt+，分泌IL-22或 IL-17的 ILC 称为 ILC3［17］。

除上述NK细胞在组织局部表现出不同功能以外，我们也发现在SLE患者体内，由于IFNα高表达活化CD226+NK细胞，后者浸润肾脏组织，介导肾脏损伤［18］。我们在肿瘤组织中发现，肿瘤浸润NK细胞(TINK)以CD27－CD11b－DN NK居多，失去杀伤肿瘤的功能。在HBV免疫耐受期(IT期，HBV DNA阳性、肝功能正常)病人体内的NK细胞，两种重要的活化性受体或共刺激分子NKG2D和2B4及其接头分子DAP10和SAP均明显降低，导致NK细胞表现为耐受状态，失去效应功能，HBV得以在体内持续性感染［19］。

4 NK细胞发育分化与功能极化机制知之甚少

NK细胞前期发育、亚群分化和功能极化的过程已经如上所述，但调控上述过程发生的机制知之甚少，远达不到对T细胞亚群极化和功能调控的认识水平，但借鉴T细胞的知识，可以推测NK细胞从外周进入组织、在局部变换功能，可能需要趋化因子驱动、黏附分子固着和转录因子激活等必要条件。

NK细胞表达多种趋化因子受体［20］，受局部组织微环境分泌趋化因子的影响，可能被吸引至不同组织，如静息状态的CD56dimCD16+NK细胞高表达CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4 和 CX3CR1;静息状态的 CD56brightCD16－NK细胞高表达 CCR5和CCR7。这些受体与对应的趋化因子相互作用，调控NK细胞向不同组织中迁移、募集继而发挥生物学功能，如妊娠期间外周血CD56hiCD16－NK细胞能在趋化因子CXCL12等的招募下迁移至子宫局部。

NK细胞还表达黏附分子受体CD2、CD226、β1 integrins和β2 integrins等，对NK细胞在组织居留和捕获靶细胞至关重要。如NK细胞能够杀伤多种高表达CD226分子配体的实体瘤细胞和造血系统来源的肿瘤细胞，当NK细胞与肿瘤靶细胞相互接触时，CD226、LFA-1等黏附分子与肿瘤细胞表达的配体分子相互作用，随后可能会引起细胞骨架的改变并引起活化性受体在NK细胞表面成簇，最终促使NK 细胞的激活［21］。

转录因子激活可能是NK细胞发育分化和功能极化的关键因素，虽然目前在此领域研究进展缓慢，但仍有部分可喜结果。如E4pb4、Id2和PU.1可促使 NK 前体细胞发育为静止 NK 细胞［22，23］，T-bet可维持NK细胞的谱系发育和NK细胞库的稳态，T-bet和Eomes可共同促进NK细胞的成熟，直至发挥效应功能［24，25］。需要指出的是，有关结果主要从小鼠的研究中获得。除此之外，我们证明microRNA也可调控NK细胞的功能，我们发现胚胎局部的NK细胞高表达miR-483-3p，该分子在胚胎NK细胞中的表达量是正常NK细胞表达量的近万倍，导致胚胎NK细胞不能分泌生长因子IGF-1，失去杀伤功能，转而分泌 IFN-γ，维持免疫调节功能［26］。

5 小结

NK细胞发育分化和功能极化机制研究缓慢的主要障碍是临床基础研究缺乏直接分析人体NK细胞的手段，实验动物研究缺乏NK细胞各种缺陷鼠，但随着体外NK细胞发育分化体系的建立，和各类组织中NK细胞功能的陆续鉴定，我们对人NK细胞的发育分化和功能极化有了较深入的认识，初步认为NK细胞在生理和病理微环境中，可能发生“程序性增殖”现象，表现为生理微环境中的SCF、Flt3-L、IL-7和IL-15等多种细胞因子启动NK细胞的发育分化，病理微环境中不断产生并积聚的炎性因子，持续性、进行性促进NK细胞的增殖和功能极化，当NK细胞到达炎症核心部位、也是局部炎性因子浓度最高部位时，终于获得特定的免疫功能，类似现象在CD8+T细胞中已有初步描述［27］。概括而言，生理微环境赋予NK细胞的发育分化，病理微环境诱导NK细胞的“程序性增殖”，转录因子介导NK细胞的功能极化，导致NK细胞在不同微环境中表现为NKtolerant(抑制性信号占主导、NK细胞失去效应功能)、NKcytotoxic(活化性信号占主导、靶细胞高表达压力诱导的配体)、NKregulatory(活化性信号占主导、靶细胞高表达炎性分子)等不同功能状态，最终在效应微环境中发挥机体所需要的免疫功能(图1)。

图1 NK细胞的发育分化与功能极化Fig.1 Development，differentiation and functions of NK cells

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