石杉碱甲快速检测酶联免疫试剂盒的制备①

余宇燕 邹艳辉 邱亚利 滕海英(福建中医药大学药学院，福州350122)

石杉碱甲(Huperzine A，HupA)是从石杉科石杉属植物蛇足石杉［Huperzina serrata(Thumb.)Trev］的酚性部分中提取的一种新型石松类天然生物碱。作为第二代乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)抑制剂，具有高效、高选择性、可逆性等特点［1，2］。目前石杉碱甲主要用于阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)的治疗，可显著改善记忆功能损伤和行为与心境障碍。国内外学者研究证实，石杉碱甲对血管性痴呆(Vascular dementia，VD)、智力低下、精神分裂症及重症肌无力等患者有一定的治疗作用［3］。

目前测定 HupA 最常用的方法是色谱法［4，5］，但需要繁琐的样品处理步骤、昂贵的仪器以及专业的操作技能，不适合用于批量样品的快速筛选和检测。而免疫分析法具有简单、灵敏度高、特异性强等优点，国外已发明各种快速检测试剂盒且技术成熟，国内的免疫分析快速检测试剂盒技术研究也逐步发展。本实验采用自制石杉碱甲人工抗原［6］免疫实验动物，获得具有较高效价和特异性石杉碱甲单克隆抗体，建立间接竞争酶联免疫法，研制能快速检测HupA的间接竞争法酶联免疫试剂盒，该方法对仪器设备和人员操作的要求较低，检测成本低，能够满足对大批量样品检测的需要。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 酶标仪680(美国Bio-Rad公司);电泳仪、垂直电泳槽(美国 Bio-Rad公司);TGL-16G型高速离心机(上海安亭科学仪器厂);PHS-3C型精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)。

试验动物5～6周龄，BALB/c雌性小鼠，由福建中医药大学实验动物中心提供。SP2/0骨髓瘤细胞由上海友科生物技术公司提供。石杉碱甲(纯度＞99%，万邦药业有限公司);士的宁、乌头碱、次乌头碱、延胡索乙素、小檗碱标准品(中国药品生物制品检定所);HupA-BSA免疫原(自制);弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)、鼠源性单克隆抗体亚型检测试剂盒(美国Sigma公司);Protein G亲和层析柱(GE公司);羊抗鼠酶标二抗(上海友科生物技术有限公司);Super-Bradford蛋白定量试剂盒(康为世纪生物科技有限公司);石杉碱甲片(上海复旦复华药业有限公司，批号:120301);其他试剂均为国产分析纯。

1.2 单克隆抗体的制备 用HupA-BSA免疫原与弗氏完全佐剂(弗氏不完全佐剂)等体积乳化后，皮下、肌肉多点免疫BALB/c小鼠，每两周加强免疫一次，免疫4～6次，检测其效价。将效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG)下融合，获得阳性杂交瘤细胞。加入小鼠腹腔饲养细胞与融合细胞共培养，并筛选阳性株。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到能稳定分泌抗石杉碱甲抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱导法生产单克隆抗体，将杂交瘤细胞注入预先腹腔注射液体石蜡的小鼠腹腔内，7～10 d后腹腔下围穿刺回收腹水。采用辛酸硫酸铵沉淀法、Protein G亲和层析法纯化抗体，检测抗体效价和纯度［7］。按照Sigma公司鼠源性单克隆抗体亚型检测试剂盒的步骤对所制备抗体的亚型进行鉴定。

1.3 ELISA基本程序 用pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释，以 100 μl/孔，4℃过夜;用 PBST(含0.05%Tween 20 的 pH7.2 PBS)洗板 3 次，拍干，加入封闭液，200 μl/孔，37℃ 孵育 2 h;用 PBST洗板3次，拍干，加入用PBST倍比稀释的抗体100 μl/孔(或不同浓度的石杉碱甲标准溶液及倍比稀释的抗体各50 μl)，37℃孵育1 h;用 PBST洗板3次，拍干，加入新鲜稀释的酶标二抗，100 μl/孔，37℃孵育40 min;用PBST洗板3次，拍干;迅速加入新鲜配制的TMB显色液，100 μl/孔，37℃孵育10～15 min，显色到一定程度时，及时加入 2 mol/L H2SO4终止反应，50 μl/孔。静置 5 min，使反应终止彻底、颜色均一。在酶标测定仪上，于450 nm测吸光值，以空白孔调零，测定各孔的OD450值［8］。阴性对照用免疫前的小鼠血清，空白对照为PBS。每一稀释比的供试品设置3个平行。

1.4 ELISA方法的确定

1.4.1 最佳抗体的选择 根据纯化后抗体的效价结果，选择OD450值接近1.0的抗体稀释倍数作为ELISA工作条件，选择IC10最低的单克隆抗体作为最佳抗体。

1.4.2 包被抗原和抗体稀释倍数的确定 采用方阵滴定法，包被缓冲液梯度稀释包被抗原后纵向加入酶标板，稀释倍数分别为 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 000，4℃ 包被过夜;PBST 梯度稀释抗体后横向加入酶标板，稀释倍数分别为1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000、1∶8 000。以倍比稀释的包被抗原和抗体稀释液进行ELISA检测，反应后比较各组的OD450值，以OD450值接近1.0时的包被抗原和抗体稀释倍数为ELISA最佳工作条件。

1.4.3 酶标二抗稀释倍数的选择 按上述确定的最佳反应条件，选择酶标二抗的稀释度为1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000。以 OD450值接近 1.0时的酶标二抗稀释倍数为最佳ELISA工作条件。

1.4.4 TMB底物作用时间的选择 按上述确定的最佳工作反应条件进行实验，加入TMB底物反应液，分别孵育 5、10、15、20 min显色，终止。根据每组阳、阴性的OD450值的比值(P/N)，确定TMB底物的最佳作用时间。

1.4.5 标准曲线的建立 试剂盒对不同浓度的HupA 标准液(1、5、10、50、100、500、1 000、2 500 ng/ml)进行检测。以HupA标准品浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准工作曲线，求出相应的相关指数和回归方程。

1.5 HupA酶联免疫检测试剂盒组成 试剂盒主要由以下内容组成:①HupA-OVA包被的96孔酶标板，1块;②HupA标准液:浓度为0.1 mg/ml的标准储备液，5 ml/瓶，1 瓶，临用前配制成 1、5、10、50、100、500、1 000、2 500 ng/ml的标准溶液;③HupAMcAb:含有 0.1～ 1.0 μg/ml的抗体，10 ml/瓶，1瓶;④酶结合物工作液:HRP标记的羊抗鼠稀释液，10 ml/瓶，1瓶;⑤TMB显色剂:显色A(10 mg TMB溶于 10 ml无水乙醇)、B液(柠檬酸 0.51 g;Na2HPO4·12H2O 1.84 g;H2O20.1 ml;高纯水 10 ml，混匀)，10 ml/瓶，各 1 瓶;⑥终止液:2 mol/L H2SO4，6 ml/瓶，1 瓶;⑦洗涤液:0.01 mol/L pH7.2～7.4 PBST，200 ml/瓶，1 瓶。试剂盒于4℃冰箱内保存备用。

1.6 试剂盒的方法学考察

1.6.1 灵敏度试验 随机选择20个孔检测HupA标准品零含量，X即所得20个孔OD450值的平均值，SD是标准差，检测限即为X-3SD所对应的浓度，进行10次标准曲线试验。

1.6.2 精密度试验 依据已确立的反应体系和标准工作曲线，随机选择3块酶标板，每块抽出5个微孔，测定50 ng/ml标准溶液的OD450值，计算其平均值和变异系数。

1.6.3 重复性试验 石杉碱甲片样品溶液:取石杉碱甲片20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于石杉碱甲50 μg)置50 ml容量瓶中。加5 ml甲醇，振摇超声30 min，加 PBST定容，摇匀。精密量取1 ml置10 ml容量瓶，加PBST定容，作为石杉碱甲片提取液。取石杉碱甲片样品6份，每份样品平行5次，测定样品溶液的OD450值，计算其含量和变异系数。

1.6.4 保存期测定 在不同时间取试剂盒进行检测其吸光值的变化，以判断试剂盒的保存期限。

1.6.5 交叉反应率 HupA结构复杂，故采用其与几种常见生物碱进行交叉反应率试验，从而反映其特异性。分别取HupA和其他生物碱(士的宁、乌头碱、次乌头碱、延胡索乙素及小檗碱)标准溶液，利用检测试剂盒进行检测，建立标准曲线，从曲线上查出50%OD450值所对应的竞争物的浓度即为IC50值。根据下列公式计算HupA与其他生物碱的交叉反应率。交叉反应率CR%=IC50HupA/IC50类似物×100%。

1.6.6 回收率试验 依据已确立的反应体系和标准工作曲线，测定添加了80%、100%、120%3个浓度的石杉碱甲标准品的样品，每个浓度做3份，每份样品平行3次，计算药物含量、添加回收率和变异系数。

1.7 样品测定

1.7.1 试剂盒测定石杉碱甲片中石杉碱甲的含量

用已研制的试剂盒对石杉碱甲片样品溶液进行检测，平行测3次，根据OD450值计算石杉碱甲片中石杉碱甲的含量。

1.7.2 HPLC法测石杉碱甲片中石杉碱甲的含量精密称取HupA标准品1.01 mg，置于10 ml容量瓶中加入2%酒石酸使溶解，定容，作为对照品贮备液(含HupA 0.101 mg/ml)，并分别稀释成 1、6、12、18、24 μg/ml的系列标准溶液。

HPLC法的色谱条件:日本岛津LC-20A型高效液相色谱仪，Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为甲醇 －0.08 mol/L 醋酸铵溶液(30∶70)。设定流速为0.8 ml/min，检测波长308 nm，进样量20 μl，柱温30℃。将系列标准溶液和石杉碱甲片提取液，按上述条件依次上样。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程式，根据方程式计算石杉碱甲片中石杉碱甲的含量。

2 结果

2.1 单克隆抗体的制备 融合前3 d对小鼠血清进行效价与特异性检测。选取效价高(＞105)、抑制率好的小鼠进行冲击免疫。取冲击免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，融合率约为45.2%。ELISA法检测细胞上清液，选择阳性孔再进行抗石杉碱甲抗体特异性检测，选择抑制率高的孔用有限稀释法进行4次亚克隆，筛选到四株效价与特异性均较好的单克隆细胞株，命名为3E02、4B01、5D03和4C04。对四株细胞株扩大培养，制备腹水并用Protein G亲和层析法纯化抗体。

2.2 单克隆抗体性质鉴定

2.2.1 效价的测定 将纯化前的腹水和纯化后的抗体以相同的浓度梯度进行稀释，ELISA方法测定效价，结果3E02、4B01、5D03和4C04纯化前的效价分别为 1∶256 000、1∶128 000、1∶128 000 和1∶128 000，纯化后的效价为 1∶128 000、1∶32 000、1∶32 000和1∶32 000。纯化后的腹水效价较纯化前有所下降，可能是在纯化时进行适当的稀释和透析，使其效价降低。

2.2.2 纯度鉴定 腹水经Protein G亲和层析法纯化后，抗体纯度较高，抗体二硫键断开后的重链分子质量约为50 kD，轻链分子质量约为25 kD，可用于分析相关特性。

2.2.3 蛋白质含量测定 根据 Bradford法检测Protein G亲和层析法纯化后的单克隆抗体浓度，其结果见表1。

2.2.4 免疫球蛋白亚型鉴定 结果如表2所示:3E02的亚类为 IgG2b、kappa、4B01的亚类为 IgG2b、kappa;5D03的亚类为IgG1、kappa;4C04的亚类为IgG1、lamda。

表1 单克隆抗体纯化后蛋白质含量Tab.1 Protein content of purified McAb

表2 单克隆抗体亚类鉴定结果Tab.2 Subclassing test results of anti-melamine McAb

表3 试剂盒保存期试验结果Tab.3 Validity of ELISA kits

表4 交叉反应试验Tab.4 Cross reactivity of antibody for compounds

2.3 ELISA最佳工作条件的确定

2.3.1 最佳抗体的选择 单克隆抗体中3E02、4B01、5D03和4C04的稀释倍数分别为1∶8 000、1∶4 000、1∶4 000、1∶2 000，进行 ELISA。结果选择IC10=5.163最低的5D03为最佳抗体。

2.3.2 包被抗原和抗体稀释倍数的确定 采用方阵滴定法进行ELISA测定，确定包被抗原浓度和抗体稀释倍数，分析表中结果，发现有1∶100(1∶5 000)、1∶200(1∶5 000)、1∶400(1∶4 000)及 1∶800(1∶3 000)的OD450值在1.0左右，综合各方面原因，选择包被抗原稀释倍数为1∶200，抗体稀释倍数为1∶5 000作为最佳工作条件。

2.3.3 酶标二抗稀释倍数的选择 通过倍比稀释的酶标二抗进行ELISA检测，比较各组的OD450值，以OD450值接近1.0时的酶标二抗稀释倍数为最佳ELISA工作条件，本试验选择酶标二抗稀释倍数为1∶10 000。

2.3.4 TMB底物作用时间的选择 对不同的底物作用时间进行考察，如比较各组的OD450值，结果以P/N最大时的TMB底物作用时间为最佳ELISA工作条件，本试验选择TMB底物作用时间为15 min。

2.4 ELISA方法学考察

2.4.1 标准曲线的建立 以HupA标准样品浓度对数值为横坐标，以抑制率为 Y轴作图，其中，抑制率=(参照 OD450-待测 OD450)/参照 OD450×100%，得到石杉碱甲的标准曲线的回归方程y=0.363x－0.237 7，R=0.992 0，其线性范围为:5～2 500 ng/ml。

2.4.2 灵敏度试验 进行10次标准曲线试验，最终结果检测限为6.242 ng/ml。

2.4.3 精密度试验 随机取3块不同的96孔酶标板，变异系数分别为 1.2%、1.0%、1.2%，结果在允许范围之内，结果较为可靠。

2.4.4 重复性试验 石杉碱甲片样品6份的含量平均值为359.103 μg/g和变异系数为 7.1%，变异系数在允许范围之内，结果较为可靠。

2.4.5 保存期试验 在不同时间取试剂盒进行检测，其吸光值的变化如表3，试剂盒在4℃或－20℃下至少可保存6个月以上。

2.4.6 交叉反应率试验 交叉反应率测定结果见表4，HupA与其他生物碱的交叉反应率均小于

0.01%，说明其特异性高。

2.4.7 回收率试验 石杉碱甲的回收率实验结果在94.2%～108.6%之间，变异系数范围在2.3%～4.8%之间。结果表明变异系数在允许范围之内，方法可行。

2.5 样品测定

2.5.1 试剂盒测石杉碱甲片中石杉碱甲的含量利用试剂盒对石杉碱甲片提取液进行检测，平行进行3次，根据 OD450值，计算石杉碱甲片含量为358.402 μg/g。

2.5.2 HPLC法测石杉碱甲片中石杉碱甲的含量

以浓度X(μg/ml)为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制HPLC法的标准曲线，回归方程为y=59 171x-40 514，r=0.999 3。根据回归方程来计算石杉碱甲片中 HupA 的含量为368.430 μg/g。

3 讨论

本试验利用制备的HupA人工抗原免疫动物，将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，获取HupA的单克隆抗体，建立HupA酶联免疫分析法，并制备HupA检测试剂盒。经HPLC法验证，样品的试剂盒检测结果与HPLC的测定结果基本一致，本试验结果可信，并且灵敏度远高于HPLC［9］。因为HupA试剂盒具有样品前处理简便，灵敏，经济，样品量少，可实现高通量筛选以及可用于现场检测等优点，可能成为测定中药及其制剂中HupA含量的强有力工具，从而对其进行质量控制和药理标准化研究。

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