姜黄素对骨髓瘤细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制研究*

马泳泳， 黄 进， 周淑娟， 葛杭萍， 俞 康

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种起源于B淋巴细胞系并能够产生单克隆免疫球蛋白(M蛋白)的恶性增生性疾病［1］，中老年人易患，是血液系统第二大常见恶性肿瘤。MM的发病是一个极其复杂的病理生理过程，其中遗传学异常、骨髓微环境、细胞因子网络，在MM的发病机制中起着重要作用［2-3］。

姜黄素(curcumin)是从草本植物姜黄的根茎中提取出来的酚类色素。近年被证实其主要药理作用是通过调控特定的靶基因如生长因子、转录因子等发挥抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化、抗病毒等作用［4-6］。已有报道姜黄素能抑制人体多种肿瘤细胞的生长，包括小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌等［7-10］。不同的肿瘤细胞系涉及不同的机制。姜黄素对骨髓瘤细胞的作用主要集中在其抑制肿瘤细胞的生长、增殖及促进凋亡，但对其迁移侵袭能力并无相关研究。含IQ模序的RasGTP酶活化蛋白1(IQ motif-containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1)是一个细胞骨架结合蛋白，通过接收和发射各种信号调节细胞迁移和细胞间黏附，促进细胞的迁移［11-12］。我们的前期工作已证实IQGAP1在骨髓瘤细胞中表达增高［13］。IQGAP1是否在骨髓瘤细胞的迁移和侵袭中起到重要作用?姜黄素是否能对IQGAP1在骨髓瘤细胞的迁移和侵袭中发挥的作用有抑制或阻断?本研究期望为MM的临床治疗提供新思路及实验依据。

材料和方法

1 主要药品和试剂

姜黄素(Sigma)用二甲基亚砜配成8 mmol/L储存液，使用前用无菌PBS稀释至工作浓度。RPMI-1640培养液为 Gibco产品，胎牛血清(fetal calf serum，FCS)购自杭州四季青生物公司，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。Matrigel胶购自Becton Dickinson。Costar 3422 Transwell小室购自Corning。

2 主要方法

2.1 细胞株的培养 人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226由温州医学院内科实验室长期保存，实验前从－196℃液氮罐中取出，快速复苏后用用含10%FCS的RPMI-1640培养液重悬后，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2～3 d换液1次。选择对数生长期细胞进行实验。

2.2 IQGAP1沉默及转染RPMI8226细胞 参照文献［13］选择 RPMI8226-shIQGAP1(clone 1)沉默 IQGAP1。

2.3 IQGAP1蛋白的检测

2.3.1 质粒转染 RPMI8226细胞后，收集 RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和RPMI8226组细胞，行2.3.3步骤实验。

2.3.2 取对数生长期细胞，按1×109/L密度接种于6孔板内。姜黄素 0、20、30及 40 μmol/L作用RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞24 h，行2.3.3步骤实验。

2.3.3 抽提蛋白，电泳，转膜，经5%脱脂奶粉封闭后，与1∶500稀释度的抗IQGAP1抗体和适宜稀释度的Ⅱ抗(羊抗鼠Ig-HRP)孵育，经Odyssey显色系统显色，收集蛋白印迹图。

2.4 迁移能力的测定

2.4.1 取对数生长期细胞，按1×109/L密度接种于6孔板内。细胞分为姜黄素 0 μmol/L组、20 μmol/L 组、30 μmol/L 组和 40 μmol/L 组，亚组分 3组:RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组，每组设3个复孔。培养箱中培养24 h后行2.4.2步骤迁移实验。

2.4.2 将 0.8 μm 孔径的 Transwell小室套入 24 孔板中，上腔中加入200 μL RPMI-1640培养液，37℃放置1 h。收集各组细胞，用无血清培养液洗涤和重悬各组细胞，并将细胞浓度调整至1×109/L。小心弃除Transwell小室中的培养液，均匀加入200 μL各组细胞悬液至小室上腔。通过间隙加入600 μL含10%FBS的RPMI-1640培养液至下腔，避免产生汽泡，培养箱培养48 h后将Transwell小室取出。分别收集各组穿过滤膜进入小室下腔的细胞，制成20 μL细胞悬液。吸取少量悬液充满计数板池，在显微镜下计数细胞。

2.5 Matrigel侵袭实验

2.5.1 取对数生长期细胞，按1×109/L密度接种于6孔板内。细胞分为姜黄素 0 μmol/L组、20 μmol/L 组、30 μmol/L 组和 40 μmol/L 组，亚组分 3组:RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组，每组设3个复孔。培养箱中培养24 h后行2.5.2步骤Matrigel侵袭实验。

2.5.2 将－20℃保存的Matrigel，在冰上4℃过夜融化，在冰上用预冷的枪头吸取100 μL Matrigel加入冰预冷的300 μL无血清培养液中，充分混匀。取上述稀释的Matrigel 50 μL加入Transwell板上室，覆盖整个聚碳酯膜，37℃放置30 min，使Matrigel聚合成胶。细胞接种密度为2×108/L。接种方法、观测时间及细胞收集、计数方法同迁移实验。

2.6 RT-PCR法检测姜黄素作用后IQGAP1 mRNA的表达 取对数生长期细胞，按1×109/L密度接种于6孔板内。姜黄素0或40 μmol/L作用于 RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞24 h，采用RNeasy Mini试剂盒分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。参照OneStep RT-PCR试剂盒实验操作说明进行RT-PCR［14］。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度姜黄素对RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞迁移及侵袭力的影响

Transwell迁移实验结果显示，0 μmol/L姜黄素作用于RPMI8226-shIQGAP1组24 h后，穿过滤膜进入下腔的细胞数明显少于RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组，差异显著(P＜0.05);在RPMI8226-shRNA 阴性对照组，经姜黄素20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L 作用后的组穿过滤膜进入下腔的细胞数较0 μmol/L姜黄素组明显减少，差异显著(P＜0.05);未转染RPMI8226细胞经姜黄素 20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L 作用后，穿过滤膜进入下腔的细胞数较0 μmol/L姜黄素组明显减少，差异显著(P＜0.05);经姜黄素20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L 作用后的同一浓度组内RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组穿过滤膜进入下腔的细胞数无显著差异，见表1。

Transwell侵袭实验也显示，经0 μmol/L姜黄素作用后RPMI8226-shIQGAP1组进入下腔的细胞数明显少于RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组，差异显著(P＜0.05);在RPMI8226-shRNA 阴性对照组，经姜黄素 20 μmol/L、30 μmol/L 和40 μmol/L作用后进入下腔的细胞数较0 μmol/L姜黄素组明显减少，差异显著(P＜0.05);未转染RPMI8226 细胞经姜黄素 20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L作用后，进入下腔的细胞数较0 μmol/L姜黄素组明显减少，差异显著(P＜0.05)。经姜黄素20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L 作用后的同一浓度组内 RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组进入下腔的细胞数无显著差异，见表2。

表1 姜黄素对不同RPMI8226细胞迁移力的影响Table 1.Migration of RPMI8226 cells treated with curcumin(Mean±SD.n=3)

表2 姜黄素对不同RPMI8226细胞侵袭力的影响Table 2.Invasion of RPMI8226 cells treated with curcumin(Mean±SD.n=3)

2 RT-PCR检测姜黄素对不同RPMI8226细胞IQGAP1 mRNA表达的影响

姜黄素0或40 μmol/L作用于RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞24 h，RT-PCR结果提示姜黄素0 μmol/L作用后，RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞表达IQGAP1 mRNA，而RPMI8226-shIQGAP1组无IQGAP1 mRNA表达;姜黄素40 μmol/L作用后，3组均未见IQGAP1 mRNA表达，见图1。

Figure 1.RT-PCR showed the mRNA expression of IQGAP1 in RPMI8226 cells treated with curcumin.图1 RT-PCR检测姜黄素对不同RPMI8226细胞IQGAP1 mRNA表达的影响

3 Western blotting检测姜黄素对不同RPMI8226细胞IQGAP1蛋白表达的影响

姜黄素 0、40 μmol/L 作用于 RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞24 h，Western blotting结果提示姜黄素0 μmol/L作用后，RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞表达IQGAP1蛋白，而RPMI8226-shIQGAP1组无IQGAP1蛋白表达;姜黄素40 μmol/L作用后，3组均未见 IQGAP1蛋白表达，见图2。

Figure 2.Western blotting showed the protein expression of IQGAP1 in RPMI8226 cells treated with curcumin.图2 Western blotting检测姜黄素对不同RPMI8226细胞IQGAP1蛋白表达的影响

讨 论

姜黄素是一种植物多酚，具有多方面的药理作用如抗肿瘤、抗炎、抗氧化等，其抗肿瘤作用正日益受到国内外学者的关注。大量实验研究表明，姜黄素对不同组织来源的恶性肿瘤细胞，如胃癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病等细胞系都显示了良好的抗肿瘤活性，可以抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和耐药，具体机制十分复杂。但姜黄素对骨髓瘤细胞迁移和侵袭能力的影响并无相关研究。

IQGAPs是近年新发现的一个蛋白家族，IQGAP1是Rho家族GTP酶成员Rac1和Cdc42的一个重要的效应因子，能与细胞骨架和黏附成分广泛作用［15-18］，通过调节分裂原激活蛋白激酶途径，可以影响细胞增殖和分化，在细胞黏附和迁移的信号网络中发挥关键作用［19-21］。IQGAP1位于染色体15q26上，是基因扩增热点。

在本研究的Transwell迁移实验中，未转染RPMI8226 细胞经姜黄素 20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L作用后穿过滤膜进入下腔的细胞数较0 μmol/L姜黄素组明显减少，差异显著(P＜0.05);同样，在Transwell侵袭实验也显示未转染RPMI8226细胞经姜黄素 20 μmol/L、30 μmol/L 和 40 μmol/L作用后进入下腔的细胞数较0 μmol/L姜黄素组明显减少，差异显著(P＜0.05)。以上实验结果提示:姜黄素对骨髓瘤细胞的迁移和侵袭有抑制作用。

shRNA表达质粒沉默IQGAP1后转染RPMI8226细胞，Western blotting检测 RPMI8226-shIQGAP1组的IQGAP1蛋白较另2组表达减少，差异显著。之后在Transwell迁移实验中，姜黄素0 μmol/L处理RPMI8226-shIQGAP1组24 h后，穿过滤膜进入下腔的细胞数明显少于RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组，差异显著(P＜0.05);同样，在Transwell侵袭实验，经0 μmol/L姜黄素作用后RPMI8226-shIQGAP1组进入下腔的细胞数明显少于RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组，差异显著(P＜0.05)。上述实验结果提示，IQGAP1在骨髓瘤细胞的迁移和侵袭中起到重要作用。

姜黄素对IQGAP1蛋白及mRNA的表达同样有抑制作用。在姜黄素40 μmol/L作用于RPMI8226-shIQGAP1组、RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组细胞24 h，3组均未见IQGAP1蛋白及mRNA表达，而姜黄素0 μmol/L(对照组)作用24 h后，RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染 RPMI8226组细胞可检到IQGAP1 mRNA及蛋白表达。

姜黄素是否能对IQGAP1在骨髓瘤细胞的迁移侵袭发挥的作用有抑制或阻断呢?shRNA表达质粒沉默IQGAP1后转染RPMI8226细胞，在RPMI8226-shIQGAP1 组，姜黄素0 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L处理组的Transwell迁移实验中穿过滤膜进入下腔的细胞数无显著差异，证实除IQGAP1的影响因素外可能不存在其它影响RPMI8226细胞迁移的因素;在Transwell侵袭实验，结果相似。而在RPMI8226-shRNA阴性对照组和未转染RPMI8226组，经姜黄素 20 μmol/L、30 μmol/L 和40 μmol/L 作用后的同一浓度组内穿过滤膜进入下腔的细胞数无显著差异，亦提示在姜黄素对RPMI8226细胞迁移的抑制作用中，影响因素单一;在Transwell侵袭实验，结果相似。因此，本研究证实姜黄素通过抑制IQGAP1的表达降低骨髓瘤细胞的迁移力和侵袭力。本研究有望为MM的临床治疗提供新思路及实验依据。

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