硫化氢对糖尿病大鼠ED的影响和机制研究*

毛玉山， 叶小磊， 麦一峰， 王少敏， 洪中立， 王黎明， 赵廷启， 王铁樵， 吕 迪， 何文明

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是指阴茎不能达到和(或)维持足够的勃起以完成满意的性交，且病程至少持续6个月以上。据估计目前全世界约有1亿5千万男性受此困扰。ED作为糖尿病(diabetes mellitus，DM)的主要并发症在中国糖尿病患者中的发生率高达35% ～75%，比非糖尿病患者高3倍多，并随年龄和病程的增长而明显增加，症状也比一般患者要严重［1］。糖尿病患者易伴发ED的主要原因是体内高血糖致血管内皮功能受损。由于受损的内皮细胞无法产生足够血管舒张因子一氧化氮(nitric oxide，NO)，进而影响阴茎血管舒张和勃起［2］。除NO之外，另一种新型气体信号分子硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)正日益受到人们的关注。作为NO和一氧化碳(carbon oxide，CO)之后被发现的第三种气体信号分子，H2S在心血管、神经、消化、呼吸、内分泌、血液、免疫和泌尿系统中发挥广泛生物学效应，并通过多种方式影响多个器官、组织的生理功能［3］。生理浓度的H2S可以直接或者协同NO舒张血管。内源性H2S以L-半胱氨酸(L-cysteine，LCys)为底物通过胱硫醚β-合酶(caystathionine β-synthase，CBS)和(或)胱硫醚 γ-裂解酶(cystathionine γlyase，CSE)的催化而来［3］。有研究显示，家兔阴茎海绵体组织中不仅可以合成内源性的H2S，而且在离体组织中加入硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS)后可以松弛阴茎海绵体，进一步研究还发现，L-Cys/H2S途径直接调节人阴茎海绵体平滑肌松弛过程［4］。本研究采用糖尿病性ED大鼠模型，探索H2S对糖尿病大鼠勃起功能的作用，同时观察其对CSE活性和表达水平的影响。

材料和方法

1 材料及试剂

NaHS和阿朴吗啡(apomorphine，APO)均购自Sigma;链脲佐菌素(streptozocin，STZ)购自 Alexis;CSE抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。其余试剂均为分析纯或者分子生物级别，购自阿拉丁公司或国药集团化学试剂有限公司。

2 动物模型的建立及给药方案

SD雄性大鼠70只，8周龄，体重200～220 g。进入实验前，经与发情雌鼠交配实验证实具有正常的性功能。置于12 h光照/黑暗交替环境中，并给予自由饮水和摄食。适应性饲养1周后，随机留取10只作为正常组，剩余大鼠禁食8 h，用0.1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，在冰浴中配制20 g/L STZ，注意避光，即配即用，按文献中剂量［5］，以 40 mg/kg对大鼠进行腹腔内注射。观察注射STZ后大鼠症状，第4天采集大鼠尾静脉血检测血糖，任意时间血糖值＞16.7 mmol/L为成功建模。剔除未发生糖尿病大鼠，对建模成功的糖尿病大鼠进行勃起功能试验(功能检测同方法3.1中描述)，筛选存在ED的糖尿病大鼠。将糖尿病合并ED的大鼠随机均分为DM组、DM+NaHS组和DM+sildenafil组。正常组和DM组每天腹腔注射0.25 mL无菌注射用水;DM+NaHS组参考文献剂量，按每天50 μmol/kg剂量给予NaHS［6］，腹腔注射0.25 mL NaHS溶液;DM+sildenafil组大鼠参考文献剂量［7］，按每天5 mg/kg剂量给予灌胃。自由饮食，每天观察大鼠阴茎勃起情况。整个实验持续12周。

3 方法

3.1 阴茎勃起功能试验 参照文献描述［8］，将成功建模的大鼠分别标记并称重，然后放入自制透明的观察箱(50 cm×30 cm×30 cm，亚克力材质)中，适应周围环境10 min，室内保持安静，光线调暗，仅够观察。每只大鼠按100 μg/kg剂量，在颈项背部皮下注射APO(溶解于含0.2 g/L维生素C的生理盐水中，调整体积为5 mL/kg)，注射后使用摄像机从观察箱底部进行拍摄观察30 min，记录阴茎有无勃起、勃起次数和有无打哈欠等情况。以龟头充血及末端阴茎体出现为阴茎勃起1次。未见勃起者为糖尿病性ED大鼠。

3.2 血液中H2S浓度检测 12周实验结束时，空腹抽取3组大鼠的动脉全血3 mL，置于含肝素的抗凝试管中，离心(4 000 r/min)20 min，取上清血浆1.5 mL存于-80℃留用。取75 μL血浆加入250 μL体积浓度1%的醋酸锌溶液，随后加入250 μL 10%三氯乙酸沉淀并终止反应，随后依次加入N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐(133 μL，20 mmol/L，溶解在 7.2 mol/L 的盐酸中)和氯化铁(133 μL，30 mmol/L，溶解在1.2 mol/L盐酸中)溶液，5 min后吸取300 μL上清于670 nm处酶标仪测值。并设立H2S不同浓度(3.125～200 μmol/L)的标准曲线，以计算和比较不同组间H2S浓度水平。

3.3 阴茎组织中CSE活性检测 12周实验结束时，脱颈椎处死大鼠，立刻割取阴茎，于体视镜下小心剥离皮肤、尿道、筋膜和白膜等。取各组中50 mg大鼠的阴茎海绵体，加入0.5 mL 50 mmol/L预冷的磷酸钾缓冲液(pH 6.8)于冰浴中制备组织匀浆，离心后取上清4 μL用于BCA蛋白定量后，取50 μL上清液加入H2S反应液(pH 7.4的100 mmol/L磷酸钾缓冲液、10 mmol/L L-半胱氨酸和2 mmol/L磷酸吡哆醛)，移至反应瓶，反应瓶中央的吸收孔中加入1%醋酸锌0.5 mL，并以滤纸浸入其中以加大吸收面积。反应瓶在封口前用氮气吹20 s，将反应瓶置于37℃水浴中孵育90 min，加入50%三氯乙酸0.5 mL，37℃孵育60 min终止反应，反应瓶中央孔的液体加入水3.5 mL、20 mmol/L对苯二胺盐酸盐0.5 mL和30 mmol/L氯化铁0.4 mL，室温静置20 min后于670 nm读取吸光度值。

3.4 阴茎组织中CSE mRNA表达检测 参照文献［9］方法，割取各组大鼠阴茎海绵体，取一部分采用Trizol一步法提取组织总RNA，剩余用于免疫印迹。M-MLV逆转录酶及Oligo(dT)15 primer室温下逆转录15 min，然后在42℃下1 h逆转录成单链cDNA。PCR 反应体积25 μL:cDNA 1 μL，CSE 上、下游引物各 1 μL(10 pmol/引物)，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，含 15 mmol/L MgCl2的 PCR 缓冲液 2.5 μL，Taq DNA聚合酶1.25 U。反应条件:95℃变性5 min，94℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，热循环30 次，72 ℃ 10 min，16℃保温。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶染色后，用凝胶成像及定量扫描仪测得不同大小条带。取2 μL PCR产物，以β-肌动蛋白(β-actin)作内参照进行PCR，30个热循环后，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像及定量扫描仪定量。重复3次独立实验。引物序列如下:CSE(NM_017074)PCR产物大小579 bp，上游引物5’-CGC ACA AAT TGT CCA CAA AC-3’，下游引物5’-GCT CTG TCC TTC TCA GGC AC-3’;β-actin(NM_031144)PCR产物大小453 bp，上游引物5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG ACA-3’，下游引物 5’-ACA TCT GCT GGA AGG TGG ACA-3’。

3.5 阴茎组织中CSE蛋白表达检测 蛋白表达使用免疫印迹法。剩余阴茎海绵体使用冷PBS淋洗2遍，尽量去除血污，切取少量后称重，按每200 mg组织1mLRIPA裂解液的比例加入，冰上电动匀浆器匀浆组织，12 000×g、4℃离心3 min后收集上清后，使用BCA试剂盒进行蛋白定量，然后在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。蛋白分离后经恒流1.5 h电转移到PVDF膜，使用含5%脱脂牛奶的封闭液封闭1 h，与CSE特异性抗体4℃孵育过夜后，次日加入羊抗兔Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL发光液，暗室中压片显影。

4 统计学处理

采用SPSS 14.0统计软件处理。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异比较采用t检验或单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 糖尿病动物模型的建立

糖尿病建模的60只大鼠，其中有49只于第4天检测血糖值＞16.7 mmol/L，说明建模成功，DM建模成功率81.7%。DM大鼠表现出明显多饮、多食、多尿、消瘦以及毛皮无光泽等典型症状。经过阿扑吗啡勃起功能测试，36只DM大鼠存在ED，发生率为73.5%。将这群DM合并ED大鼠随机分为3组:DM组、DM+NaHS组和DM+sildenafil组，每组12只。整个实验期间，正常组无大鼠死亡;DM组有2只大鼠死于第6周，1只死于第10周;DM+NaHS组有1只大鼠死于第9周;DM+sildenafil组有1只大鼠死于第4周。死亡大鼠在统计时剔除。12周实验结束时，正常组空腹血糖(4.71±0.86)mmol/L，所有DM组(18.56±2.13)mmol/L，差异显著(P＜0.05)。

2 阴茎勃起功能和血液中H2S含量测定

各组大鼠皮下注射APO后均有毛发竖立、打哈欠等表现。造模组和正常组大鼠阴茎勃起次数均有显著差异(P＜0.05)。糖尿病模型组中大鼠的阴茎平均勃起率为26.5%，有73.5%的DM大鼠存在ED，因此选择这部分大鼠进行分组后进一步研究。于给药处理12周后，检测不同组注射APO后勃起情况见表1。结果显示，与DM组比，给予NaHS或sildenafil组的勃起功能显著改善(P＜0.05)，但是勃起率与正常组大鼠比，其勃起功能没有完全恢复。DM+NaHS组的勃起率不及 DM+sildenafil组(P＜0.05)。

于12周实验结束时测定各组大鼠血液中H2S的含量，发现DM+NaHS组、DM+sildenafil组、正常组和DM组大鼠血浆中H2S浓度依次降低，各组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠注射APO后阴茎勃起情况和12周时血浆中H2S水平比较Table 1.Erectile function after injection of APO and H2S level in rat plasma 12 weeks after treatment in different groups(Mean±SD)

3 阴茎组织中CSE活性及CSE表达水平的检测

与正常组相比，各DM组CSE活性、mRNA和蛋白表达水平均有降低，其中DM+NaHS组的CSE水平最低，与正常组比差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1和表2。

Figure 1.The mRMA(A)and protein(B)expression of CSE in rat corpus cavernosum with different treatments.图1 不同处理组大鼠阴茎海绵体组织中CSE mRNA和CSE蛋白的表达

表2 各组大鼠海绵体组织中CSE活性及CSE mRNA和蛋白表达水平Table 2.The activity and mRNA and protein expression levels of CSE in rat corpus cavernosum(Mean±SD)

讨 论

DM动物模型是研究DM病理、病理生理及其并发症治疗的重要动物模型。其建模方式有多种，而腹腔注射STZ具有成本低、操作简单、成功率高、死亡率低等特点，成为最常用的建模方法。直接特异性杀伤胰岛β细胞是STZ诱发DM的主要机制［5］。本研究中DM组中出现大鼠死亡，可能与血糖过高，导致酮症酸中毒、脱水乃至昏迷有关。DM高血糖状态时，阴茎血管内皮细胞受损、海绵体平滑肌发生异常、松弛机制受损，直接影响到勃起早期的血液动力学改变，使得ED在DM患者中发生率更高。目前治疗ED的药物以5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂为主，代表药物如西地那非、伐地那非等，其作用机制是阻断PDE5，减少cGMP在细胞内的降解，导致NO-cGMP通路持续激活，使得NO的舒血管活性持续发挥;然而在临床应用过程中，约35%患者对PDE5抑制剂无效，尤其是那些合并有DM或者其它心血管疾病的患者［10］，其主要原因可能与血管内皮严重受损致使NO分泌绝对不足密切相关。在NO-cGMP通路无法被有效激活状态下，后续使用抑制cGMP降解的药物自然也无济于事。而针对H2S的研究，可能有望为克服PDE5抑制剂的局限性提供新思路。

H2S最早为人们所认识，是一种具有特殊臭味的气体，是大气的主要污染物。直至上世纪80年代，研究人员发现H2S也是体内一种内源性物质，其分子量小、结构简单、扩散迅速，且可以自由通过细胞膜，在体内扮演着信号分子角色，调节人体多种生理机能。在CSE-/-小鼠中容易发生年龄依赖性高血压，这一结果类似缺失NOS的转基因小鼠模型;而且在CSE-/-小鼠中构建心肌缺血再灌注模型后，使用PDE5抑制剂后无法显示出较为明显的心血管保护作用［11］。以上研究结果说明CSE功能受损导致H2S释放减少，无法通过提高NO利用率解决，提示H2S与NO共同参与血管内环境稳态的维持和调节。

外源性H2S可通过体外给予NaHS转化，NaHS在体内分解出HS-，然后HS-与体内的H+结合，即生成H2S。同NO一样，H2S也有较强的血管舒张作用，被认为是一种有效的钾离子通道开放剂，还可通过NF-κB通路等途径发挥心血管保护作用［12］。有研究发现，外源性H2S对阴茎海绵体也具有血管舒张和促进勃起的功能。其中一项研究显示［6］，在灵长类动物阴茎内注射20 μmol/kg NaHS后，可以同时增进阴茎的长度和海绵窦内的压力;进一步研究还发现，海绵体也具有合成内源性H2S的能力，并不依赖于血管内皮细胞而松弛平滑肌。这些研究结果表明，H2S对阴茎勃起功能有着重要调节作用，尤其是当血管内皮受损致NO途径失活后，有望成为治疗ED的另一个作用途径，其机制将迥然于PDE5类抑制剂。

本研究首先成功建立了DM大鼠模型，建模成功率达到81.7%。观察正常组、DM组和DM+NaHS组大鼠在注射了APO后的阴茎勃起情况，发现DM大鼠ED发生率超过70%，而进行了NaHS干预的大鼠ED率明显下降。同时，大鼠血液中H2S含量的检测结果也表明，DM组大鼠血液中H2S最低，正常组其次，DM+NaHS组由于给予了外源性的H2S供体NaHS，其水平也最高，说明H2S与阴茎勃起功能具有相关性，但是在勃起改善方面效果不如西地那非组。为了进一步研究H2S对动物勃起功能的影响，结合H2S在体内的生成机制，进行CSE活性及CSE mRNA和蛋白表达水平的检测。结果显示，正常组的CSE活性和CSE mRNA以及蛋白表达水平最高，而DM+NaHS组的水平最低，可能是大量外源性H2S进入体内，显著提高了体内H2S含量，进而反馈性抑制CSE的表达，从而对内源性H2S的生成途径起到抑制作用，即外源性的H2S对体内CSE活性呈负反馈调节作用，与国外的研究相符［13-14］。

本研究显示外源性补充H2S对于糖尿病ED大鼠的勃起功能具有一定治疗效果，NaHS治疗组的阴茎勃起率显著高于生理盐水对照组，但与西地那非治疗组相比，其改善勃起效果远不如后者，表明H2S补充剂NaHS在临床上取代PDE5抑制剂成为ED治疗一线用药的理论基础不强。但可否将两者合用以提高彼此疗效，可能是一个值得深入研究的方向。

总之，本实验结果证实了H2S对糖尿病ED大鼠勃起功能具有显著改善作用，且其作用机制与体内H2S生成机制CSE体系相关。尽管DM+NaHS组大鼠的ED发生率显著低于DM组，但与正常组仍有较大差距，说明NaHS治疗对大鼠阴茎勃起功能有一定保护作用，但尚不能根本解决。另外，有关外源性H2S补充剂的用药剂量、用药周期等方面还需进一步研究，可能为后续DM患者难治性ED的临床治疗提供新的思路和防治途径。

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