肌钙蛋白T基因单核苷酸多态性与运动性横纹肌溶解症的关联研究*

白春宏， 薄 海， 秦永生， 彭 朋△

运动性横纹肌溶解症(exertional rhabdomyolysis，ERM)是由于不习惯的大强度运动(特别是离心运动)造成肌肉组织崩解、细胞内容物如肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌红蛋白(myoglobin，Mb)释放入血循环、最终引起肾衰竭甚至死亡的综合征［1］。ERM典型症状为黑尿(肌红蛋白尿)、肌痛、僵硬、无力，并发症包括急性肾衰、骨筋膜室综合征、高钾血症和酸中毒等［1］。普通健康人安静时出现具有临床症状ERM的发生率极低，但在大强度运动应激时，不同个体的反应差异很大，特别是合并热应激和脱水时易出现ERM，其具体机制未明。有研究证实，ERM易感性可能与遗传因素有关［2］。本研究以武警战士为研究对象，利用一次大强度负重训练造成亚临床(非临床症状)ERM，分析慢肌型肌钙蛋白T(slow troponin T，sTnT)基因第7内含子C7761T位点与快肌型肌钙蛋白T(fast troponin T，fTnT)基因第8内含子T7955C位点单核苷酸多态性与大强度训练后血清CK含量之间的关系，探索ERM的可能遗传机制。

材料和方法

1 研究对象

武警某部战士85名，男性，年龄(23.3±1.9)岁，身高(1.73 ±0.04)m，体重(64.3 ±4.4)kg，体重指数(body mass index，BMI)(21.4 ± 1.7)kg/m2。排除安静血清CK(CKrest)超标(＞200 IU/L)者和肌炎、肌病、中暑、心血管及代谢性疾病患者。实验前2天禁止进行大强度运动训练以及肌肉治疗和服用药物(包括营养补剂)。

2 亚临床ERM实验模型的建立［3］

利用一次大强度负重训练造成亚临床ERM，具体方案:受试者用背囊进行负重，背囊重量为自身体重的30%，先进行5 min台阶试验(台阶高30 cm，登阶频率每分钟54步，用节拍器控制节律)，紧接着在1 min内完成15次蹲起，每个动作3 s蹲下(延长离心收缩时间)，2 s站起。

3 取血及血清CK测定

清晨7:00～8:00，受试者空腹状态下指尖取血20 μL，用酶动力学法测定CKrest活性(A6半自动生化分析仪)，肘静脉取血3 mL测定外周血白细胞sTnT 和 fTnT基因多态性。实验后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h 和 120 h 分别取指尖血20 μL测定血清CK活性的变化规律，记录峰值CK(CKpeak)值并计算 CK最大变化值(ΔCKmax=CKpeak－CKrest)。

4 PCR-RFLP测定sTnT和fTnT基因多态性

取100 μL全血，利用 DNA提取试剂盒(Tiangen)提取白细胞基因组DNA，－80℃低温冰箱冻存。取基因组DNA 5 μL，PCR技术扩增目的基因，引物设计和扩增片段长度见表1。反应条件为，预变性:95℃ 5 min;35个循环:95℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃30 s;72℃5 min。

sTnT基因扩增片段产物长度为221 bp，经Eco47 I内切酶消化后，出现3种基因型:有Eco47 I酶切位点的纯合型C/C为174 bp和47 bp 2条带，无Eco47 I酶切位点的纯合型T/T为221 bp 1条带，杂合型C/T为221 bp、174 bp和47 bp 3条带。fTnT基因扩增片段产物长度为287 bp，经TspE I内切酶消化后，出现3种基因型:有TspE I酶切位点的纯合型T/T为144 bp和143 bp 2条带，无TspE I酶切位点的纯合型C/C为287 bp 1条带，杂合型T/C为287 bp、143 bp和144 bp 3条带。

表1 引物设计Table 1.Primer design

5 统计学处理

采用SPSS 15.0 for Windows统计软件包分析。卡方检验计算基因型频率是否符合哈-温遗传平衡定律。按基因型分组后，组间各指标比较使用单因素方差分析，多重比较使用LSD-t检验。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 sTnT和fTnT基因的分布频率与受试者的一般特征

sTnT 3 种基因型(T/T:18.8%;C/T:49.4%;C/C:31.8%)和等位基因(T:43.5%;C:56.5%)，以及fTnT 3 种基因型(T/T:8.2%;T/C:41.2%;C/C:50.6%)和等位基因(T:28.8%;C:71.2%)的分布频率经卡方检验均为P＞0.05，符合哈-温遗传平衡定律，具有群体代表性，见表2。受试者年龄、身高、体重、BMI等特征在各组均无显著差异(均 P＞0.05)，具有可比性，见表3。

表2 sTnT和fTnT基因型及等位基因的分布频率Table 2.sTnT and fTnT genotypic and allelic distribution frequency

表3 受试者一般特征Table 3.Baseline characteristics of the subjects(Mean±SD)

2 运动训练前后血清CK的时程变化

血清CKrest为(145±33)IU/L，运动训练后24 h开始逐渐升高，72 h达峰值［CKpeak:(2 972±1 648)IU/L］，随后开始逐渐下降，见图1。

Figure 1.Time course of serum CK activity.Mean ± SD.n=85.＊＊P ＜0.01 vs rest(0 h).图1 血清CK活性的时程变化

3 不同基因型间血清CK活性的比较

sTnT基因:C/T基因型组和C/C基因型组CKrest均高于T/T基因型组(均P＜0.01)，CKpeak和ΔCKmax在各组间无显著差异(均P＞0.05)。由于T/T基因型组只有16人(18.8%)，为避免统计误差，将T/T基因型组与C/T基因型组合并为(T/T+C/T)基因型组，即T等位基因组(对fTnT的基因型进行相同的处理)，结果发现，(T/T+C/T)组 CKrest低于C/C基因型组(P ＜0.05)，见表3。

fTnT基因:T/C基因型组和C/C基因型组CKrest均低于 T/T基因型组(分别为 P＜0.05和 P＜0.01)，C/C基因型组CKpeak和ΔCKmax均低于T/T基因型组和T/C基因型组(均P＜0.01)。T等位基因组(即T/T+T/C组)CKpeak和 ΔCKmax均高于C/C基因型组(均 P ＜0.01)，见表4。

讨 论

ERM易发于士兵和运动员人群，其最危险的并发症是由于循环Mb进入肾脏造成的急性肾衰竭，特别是在热环境和脱水的情况下更容易发生。通常，反复的离心运动会造成肌细胞机械或化学应激损伤［4］，进而导致 ERM。CK 是肌肉崩解的标志物［5］，但不同个体对于大强度运动(特别是离心运动)的反应大相径庭，有报道血清CK可达到38 517 IU/L(正常值40～170 IU/L)。本研究的受试者CKrest均在正常范围内，但大强度训练后，CKpeak为(2 972±1 648)IU/L，237 ～ 7 405 IU/L，ΔCKmax则为 (2 826 ±1 649)IU/L，102 ～7 269 IU/L，即不同受试者对相同运动负荷存在显著个体差异，其具体机制未明。

表4 不同基因型间血清CK活性的比较Table 4.Comparison of serum CK activity between different genotype groups(IU/L.Mean±SD)

在排除体格、身体素质等因素后，越来越多的研究证实了遗传基因在ERM发生中的作用，但关键基因仍未明确。既往研究证实，胰岛素样生长因子-II［6］、肌酸激酶骨骼肌型［3，7］、白细胞介素 6［8］、肿瘤坏死因子 α［8］、趋化因子配体与受体［9］、α-辅肌动蛋白 3［10］、肌球蛋白轻链激酶［10］等多个基因变异与ERM易感性相关联。这些研究分别从肌肉代谢因子(酶)、炎症反应、收缩蛋白等方面探讨了相关基因多态与肌肉损伤的关系。本研究以武警战士为受试对象并参照文献［3］建立亚临床ERM实验模型(即血清CK升高，但不伴有临床症状)，从肌肉收缩钙调控的角度探讨sTnT和fTnT基因多态与ERM的关系。

ERM发生的重要机制是细胞能量代谢障碍并导致胞浆内钙离子的异常升高，细胞内钙依赖性蛋白酶及磷脂酶被激活，造成肌原纤维、细胞骨架及胞膜蛋白破坏［11-12］。丹曲林钠(骨骼肌松弛剂)可阻滞肌浆网钙释放，对过度运动性肌损伤具有显著的保护作用［13］。骨骼肌收缩时胞内钙离子调控蛋白包括肌集钙蛋白1、兰尼碱受体1、L型钙通道以及肌钙蛋白等［14］。TnT是肌钙蛋白复合体(由 TnT、TnI和 TnC构成)的一个亚基。TnT将肌钙蛋白复合体维系在细肌丝上，在骨骼肌细肌丝的Ca2+调控系统中处于核心位置。在没有TnT的情况下，无论是否存在Ca2+，肌肉同样可以被激活产生收缩。因此，TnT是在静息电位时抑制肌肉收缩不可缺少的组分，它可以将TnI和TnC不依赖于Ca2+的活性功能整合为依赖Ca2+的活性功能。人类的TnT有3种同源蛋白:sTnT、fTnT和心肌型TnT(cTnT)，分别在骨骼肌慢肌、快肌和心肌中特异性表达。研究证实，血清TnT水平是诊断运动性损伤的特异标志物，TnT相关基因多态与运动能力［15］可能也存在关联。因此我们推测，sTnT与fTnT基因多态可能与ERM易感性有关。

本研究发现，fTnT基因T/C基因型组和C/C基因型组CKrest均低于T/T基因型组，sTnT基因C/T基因型组和C/C基因型组CKrest则均高于T/T基因型组，T等位基因组CKrest低于C/C基因型组，提示fT-nT基因T/T基因型、sTnT基因C/T和C/C基因型与安静时CK高反应有关;一次负重训练后，fTnT基因T等位基因组CKpeak和ΔCKmax均高于C/C基因型组，而sTnT基因CKpeak和ΔCKmax在各基因型组间均无显著差异，说明fTnT基因T等位基因具有肌肉损伤促进作用，可能是ERM易感性的分子遗传学标记。其机制在于，剧烈运动(特别是肌肉离心收缩)时，主要是快肌纤维参与工作，fTnT在调节快肌兴奋收缩偶联中起重要作用，T等位基因(T/C+T/T)变异改变了相应蛋白质的功能，造成其对Ca2+敏感性增强，进而影响了肌肉收缩的效率，肌肉损伤和ERM易感性随之增加。

本研究证明fTnT基因第8内含子T7955C位点单核苷酸多态性可作为ERM易感性的分子遗传学标志，T等位基因携带者是患ERM的高危人群。

本研究的结果提示某些基因型或等位基因具有肌肉损伤保护或促进作用。携带fTnT基因第8内含子T7955C位点T等位基因的个体在运动应激后血清CK会大大升高，是患ERM和急性肾衰竭的高危人群。今后的研究应继续寻找ERM易感基因，从分子水平揭示CK高反应机制，为军事训练提供个性化监控指标——基因标志，同时对于筛查易感人群、及早发现运动损伤危险因素和预防ERM发生具有重要的理论和实践意义。

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