辣椒素抑制大鼠肝纤维化的实验研究*

俞富祥， 朱千东， 余正平， 张启瑜

(温州医科大学附属第一医院肝胆胰外科，浙江温州325000)

肝纤维化是各类慢性肝病共同的病理学基础。其中25%～40%最终发展为肝硬化甚至肝癌，是一类世界性的严重危害人们健康的主要疾病。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化与增殖是肝纤维化发生发展的中心环节。HSCs增殖激活后可分泌大量细胞外基质，引起胶原纤维沉积导致纤维化。阻止HSCs的增殖活化有可能阻断肝纤维化和肝硬化的进程［1-3］。辣椒素是辣椒中的主要辛辣成分，近年来的研究成果显示其具有止痛、降脂减肥及抗癌等［4-6］多种药理活性。作者前期预实验发现较低浓度的辣椒素能抑制HSCs增殖，诱导HSCs凋亡，本研究继续探讨辣椒素对HSCs活性的影响及纤维化相关基因的表达，探讨辣椒素能否用于治疗肝纤维化及其可能的作用机制。

材料和方法

1 材料及试剂

SD大鼠由温州医学院实验动物中心提供;HSCT6细胞系购自中科院上海细胞库;辣椒素购自Sigma;CCK-8购自日本同仁化学公司;DMEM和胎牛血清购自 Gibco，Bcl-2、Bax、Cyt-C 等Ⅰ抗购自 CST;Annexin V/PI apoptosis kit购自杭州联科生物技术有限公司;全自动酶标仪(Bio-Rad);FACS流式细胞仪(BD)。

2 方法

2.1 细胞培养 HSCs接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，根据细胞生长情况，每2～3 d换液1次。

2.2 DCFH-DA法检测HSCs中活性氧的水平 收集对数期细胞，用培养液稀释成细胞悬液，加入96孔板，每孔100 μL，含细胞 5×104个，加入辣椒素(0、50、100、150 和200 μmol/L)，培养24 h 后吸去上清液，加入用 DMEM培养液稀释好的10 μmol/L DCFH-DA溶液，置孵箱孵育0.5 h，用DMEM培养液洗2遍后荧光显微镜下观察荧光亮度。

2.3 CCK-8比色法检测HSCs增殖 96孔板每孔培养细胞5×104，培养24 h后按不同浓度分别向各孔中加入辣椒素 (0、50、100、150 和200 μmol/L)，每个浓度设5个复孔。培养液中辣椒素0 mg/L的HSCs为空白对照组。培养24 h后每孔加入CCK-8溶液20 μL，继续培养2 h，用自动酶标仪于450 nm处检测每孔的吸光度(A)值，间接计算细胞增殖程度。

2.4 Western blotting法检测HSCs中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达 按前述方法分组加入不同浓度辣椒素，培养48 h后，在各培养体系HSCs中分别加入现配的细胞裂解液，冰上裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清进行蛋白定量。取一定量蛋白样品上样。SDSPAGE胶电泳分离，转移至PVDF膜，封闭缓冲液室温摇床振荡1 h，加入α-SMA抗体 (1∶100)，4℃过夜，TBST 漂洗3次，10 min/次，孵育Ⅱ抗(1∶30 000)，37 ℃恒温振摇1 h;TBST漂洗3次，10 min/次，化学发光，显影、定影，对胶片图像扫描，用凝胶图像处理系统Gel-Pro Analyzer分析目标带的灰度值。

2.5 RT-PCR法检查HSCs肝纤维化相关基因表达

按前述方法根据不同辣椒素浓度分组，HSCs培养24 h，由长风生物科技公司设计大鼠基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase 1，MMP-1)、金属蛋白酶组织抑制物 1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)及内参照 GAPDH 的引物，利用 RT-PCR技术，分别测定各组细胞中上述基因的mRNA表达情况。具体如下:MMP-1上游引物 5′-CTCCCTTGGACTCACTCATTCTA-3′，下 游 引 物 5′-AGAACATCACCTCTCCCCTAAAC-3′，扩增片段长 227 bp;TIMP-1 上游引物 5′-CCTCTGGCATCCTCTTGTTG-3′，下游引物 5′-CGCTGGTATAAGGTGGTCTC-3′，扩增片段长157 bp;TGF-β1上游引物:5′-GAGGCGGTGCTCGCTTTGT-3′，下游 引 物 5′-CGGGTGACTTCTTTGGCGTAG-3′，扩增片段长 107 bp;GAPDH 上游引物 5′-GAGGACCAGGTTGTCTCCTG-3′，下游引物 5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3′，扩增片段长 215 bp;用GAPDH为内参照，分别扩增MMP-1、TIMP-1和TGF-β1。反应条件为:94℃ 5 min预变性，扩增40个循环，每个循环包括:94℃ 30 s，52.1℃ 30 s，72℃45 s。

2.6 流式细胞术检测HSCs凋亡 按前述方法根据不同浓度辣椒素浓度分组，HSCs在6孔板中作用24 h后，用不含EDTA的胰酶消化，每个样本收集约2×105个细胞，1 500 r/min离心5 min后，弃去培养液，用PBS洗涤细胞2次，1 500 r/min离心5 min，加入 200 μL binding buffer重悬细胞;加入5 μL annexin V-FITC 混匀后，再加入 5 μL propidium iodide，混匀;室温、避光反应20 min后上机检测，流式细胞仪激发波长488 nm，发射波长530 nm。

2.7 肝脏组织病理学检查 选择体质量250～300 g的SD大鼠，采用50%四氯化碳植物油溶液腹腔注射3个月，获得肝纤维化模型。将不同剂量辣椒素(0、2.5、5.0、7.5 mg/kg)分别腹腔注射肝纤维化大鼠，将正常大鼠及注射5.0 mg/kg辣椒素的正常大鼠设为正常对照及阴性对照组，每组大鼠5只，每周注射2次，共4周，最后1次注射后继续饲养1周。处死大鼠，取肝行石蜡切片和HE、α-SMA染色。

2.8 肝组织羟脯氨酸和血清III前胶原肽及透明质酸测定 使用肝羟脯氨酸试剂盒测定肝脏胶原含量。肝组织(80 mg)在冰冻条件下匀浆，匀浆液经37℃孵育消化过夜后，匀浆液离心复溶于测试液中，匀浆液中的羟脯氨酸在550 nm波长测定A值，由已知羟脯氨酸浓度的标准液的A值建立标准曲线，根据测试液的A值计算出肝组织内的羟脯氨酸浓度。按试剂盒说明采用放射免疫法测定大鼠血清Ⅲ型胶原和透明质酸水平。

3 统计学处理

数据采用SPSS 13.0统计软件处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，两样本均数间比较用t检验。多个样本均数间的比较用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 辣椒素抑制HSCs中活性氧的产生

荧光显微镜观察可见，与对照组比较，随着培养液中辣椒素浓度的增加，HSCs中活性氧的产生呈明显递减趋势，见图1。

Figure 1.The reactive oxygen species in HSCs treated with capsaicin at different concentrations(×100).A:0 μmol/L;B:50 μmol/L;C:100 μmol/L;D:150 μmol/L;E:200 μmol/L.图1 荧光法检测各培养体系HSCs中活性氧的生成

2 辣椒素抑制了HSCs的增殖

与对照组相比，随着培养液中辣椒素浓度增加，HSCs增殖程度明显下降，差别有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各培养体系中HSCs的细胞增殖程度的比较Table 1.The effect of capsaicin on the proliferation of activatedHSCs(Mean±SD.n=5)

3 辣椒素抑制HSCs中α-SMA的表达

Western blotting法检测可见，随着培养液中辣椒素浓度增加，与对照组相比较，HSCs中的α-SMA表达水平明显下降，差别有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.The effect of capsaicin on α-SMA expression in activated HSCs.A:0 μmol/L;B:50 μmol/L;C:100 μmol/L;D:150 μmol/L;E:200 μmol/L.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs A group or B group.图2 各培养体系中HSCs的α-SMA表达

4 辣椒素调节HSCs中MMP-1、TIMP-1和TGF-β1mRNA的表达

RT-PCR检测结果表明，与对照组相比，随着培养液中辣椒素浓度增加，HSCs中MMP-1 mRNA表达未见明显变化 (P＞0.05)，但 TIMP-1及 TGF-β1mRNA却呈降低趋势，差别有统计学意义 (P＜0.05)，见图 3。

Figure 3. The effects of capsaicin on MMP-1，TGF-β1and TIMP-1 mRNA expression in activated HSCs.A:0 μmol/L;B:50 μmol/L;C:100 μmol/L;D:150 μmol/L;E:200 μmol/L.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs A group or B group.图3 各培养体系中 HSCs MMP-1、TGF-β1及 TIMP-1 mRNA的表达

5 辣椒素促进了HSCs的凋亡

流式细胞术的检测结果显示，与对照组相比，随着培养液中辣椒素浓度增加，HSCs的凋亡率逐步升高，差别有统计学意义 (P＜0.05)，见图4。

Figure 4.The effect of capsaicin on apoptosis of activated HSCs.A:0 μmol/L;B:50 μmol/L;C:100 μmol/L;D:150 μmol/L;E:200 μmol/L.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs A group or B group.图4 各培养体系中HSCs的凋亡情况

6 肝纤维化模型鼠肝脏组织病理学的改变

肝脏病理切片HE染色检查发现，肝纤维化模型大鼠肝脏肝细胞呈片状坏死，肝小叶结构破坏严重，纤维间隔形成。随着辣椒素注射液剂量的增加，肝细胞变性坏死逐渐减轻，纤维间隔变窄，肝小叶结构残留增多，肝脏纤维化程度减轻，而阴性对照组肝脏病理未见明显变化，见图5。肝脏病理切片α-SMA染色检查发现，随着辣椒素注射液剂量的增加，肝纤维化模型大鼠肝组织中α-SMA表达量逐渐降低，见图6。

Figure 5.The effect of capsaicin on pathologic changes of the liver tissues in vivo(HE staining，×100).A:0 mg/kg;B:2.5 mg/kg;C:5.0 mg/kg;D:7.5 mg/kg;E:normal control group(normal rats);F:negative control group(normal rats treated with 5.0 mg/kg capsaicin).图5 各组大鼠肝脏病理切片HE染色

7 肝组织羟脯氨酸含量及血清Ⅲ型胶原和透明质酸水平的变化

检测结果显示，随着辣椒素注射液浓度的增加，肝组织羟脯氨酸含量及血清Ⅲ型胶原和透明质酸水平均呈逐渐降低趋势，各组间差别有统计学意义(P ＜0.05)，见表2。

Figure 6.The effect of capsaicin on α-SMA expression in the liver tissues in vivo(immunohistochemical staining，×100).A:0 mg/kg;B:2.5 mg/kg;C:5.0 mg/kg;D:7.5 mg/kg.图6 各组大鼠肝脏病理切片α-SMA免疫组化染色

表2 各组大鼠肝脏胶原纤维蛋白及血浆纤维化水平Table 2.The effects of capsaicin on the hydroxyproline expression in the liver tissues，and the serum levels of collagen III and hyaluronic acid in the rats with liver fibrogenesis(Mean±SD.n=5)

讨 论

我国是肝炎高发国家，肝炎迁延不愈最终发展成肝硬化，由肝硬化导致的肝功能衰竭或肝癌是引起患者死亡的主要原因，严重影响人民的健康。因此，阻断或延缓肝纤维化的发展是目前研究治疗肝硬化的关键。HSCs属于肝脏的间质细胞，它在肝纤维化过程中扮演着重要的角色。针对HSCs的治疗是预防和治疗肝纤维化的关键环节［7-9］。

辣椒素是辣椒中的主要辛辣成分。辣椒素在各种辣椒中含量从0.5%～1%不等。辣椒素具有多种药理活性，既往对辣椒素的研究主要集中于抗炎、抗氧化、止痛、抗肿瘤等的作用［10-11］，而辣椒素与HSCs的活化增殖及辣椒素与肝纤维化的关系研究则未见相关报道。

辣椒素具有抗氧化特性，它能清除自由基，终止自由基造成的脂质过氧化，有效抑制活性氧诱发的氧化应激反应，本实验结果显示，辣椒素的抗氧化作用可抑制HSCs活化增殖过程中活性氧的产生，从而参与抑制HSCs的活化与增殖过程。

HSCs活化后MMP-1表达降低而TIMP-1和TGF表达升高，升高的TIMP-1和TGF-β1反过来又可促进HSCs活化及纤维化基质的分泌，从而促进肝纤维化［8］。而本实验显示，尽管辣椒素对HSCs的MMP-1表达无明显影响，但辣椒素抑制HSCs的增殖活化，而且抑制HSCs的TIMP-1和TGF-β1表达，综合以上效应，我们认为辣椒素在减轻肝纤维化方面可能具有一定的疗效。

我们通过四氯化碳诱导建立的大鼠肝纤维化模型，经腹腔注射辣椒素的体内研究发现，辣椒素确实能在一定程度上有效抑制肝纤维化进程。对于辣椒素在体内如何起到抗肝纤维化作用，我们推测一定浓度的辣椒素可能通过抑制HSCs的增殖激活，促进其凋亡，而且抑制促纤维化基因TIMP-1与TGF-β1的表达，减缓了四氯化碳诱导的肝纤维化进程。

根据目前初步研究的结果显示，辣椒素可通过抑制HSCs的活性而发挥抗纤维化作用。但我们在研究中也发现辣椒素不仅可引起HSCs的凋亡，而且也可引起正常肝细胞的凋亡，只是肝细胞损伤变性程度较HSCs轻而已，因此，对辣椒素的活体研究有待进一步深入。

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