纤维素酶酶解-溶剂联合提取葱白中甾体化合物*

程璐，张耕

(武汉市中西医结合医院药学部，武汉 430022)

葱白为百合科植物分葱(Allium fisturosum L.vat.caespitosum Makio)或香葱(Allium schoenoprasum L.)的新鲜鳞茎。其性辛、温，具解表、通阳散寒之功效。研究表明，以葱白为原料的药物制剂可用来防治冠心病心绞痛、抗动脉粥样硬化、治疗急慢性心肌缺血、保护缺糖缺氧心肌细胞、抑制血管平滑肌细胞增生、保护内皮细胞、减轻球囊损伤后再狭窄等[1-6]。笔者在本实验中研究采用纤维素酶酶解法提取葱白中的甾体化合物，为葱白有效成分提取和研究提供新的思路。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-1601紫外-可见分光光度计(日本岛津);HHS系列电热恒温水浴锅(武汉市琴台医疗器械厂);BP310S电子天平(德国赛多利斯，d=0.001 g);ME215S电子天平(德国赛多利斯，d=0.1 mg)。九阳榨汁机(用于匀浆)。

1.2 试药 纤维素酶(BIOSHARP公司，批号:058K3787，规格:11000 U·mg－1);β-谷甾醇对照品(Sigma公司，批号:058K3787，含量 100.0%);甲醇、乙醇、硫酸、冰醋酸、三氯甲烷均为分析纯。葱(自种，经华中科技大学同济医学院药学院张长弓副教授鉴定为分葱，剪取新鲜葱白洗净)。

2 方法与结果

2.1 样品制备方法 取葱白20 g，加纯化水100mL，加纤维素酶适量，室温下匀浆5 min，放置一定时间后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液浓缩并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，精密加入硫酸-甲醇(9∶1)显色剂溶液2mL，摇匀，100℃水浴反应30 min，取出后立即用冰水浴冷却10 min终止反应，精密加入冰醋酸10mL，摇匀，即得。

2.2 对照品溶液制备方法 精密称取β-谷甾醇对照品11.35 mg，置100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。

2.3 检测波长的选择 取对照品溶液与供试品溶液各适量于具塞试管中，水浴挥干溶剂后按“2.1”项下方法显色后在300～700nm波长范围内进行扫描。结果对照品和供试品的最大吸收波长分别为386和381nm，选择386nm为检测波长。

2.4 线性关系考察 分别吸取上述溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL 置具塞试管中，水浴蒸干后加入硫酸-甲醇(9∶1)显色剂2mL，摇匀，100℃水浴反应30 min，取出后立即用冰水浴冷却10 min终止反应，精密加入冰醋酸10mL，摇匀，放置15 min后在386nm波长处测定吸光度，以吸光度(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程为:Y=0.0244X －0.0112，r=0.9998;结果表明 β-谷甾醇进样浓度与吸光度在 4.73 ～28.38μg·mL－1线性关系良好。

2.5 单因素考察

2.5.1 pH对酶解的影响 分别称取葱白20 g，分别置 pH 为 3.0，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0的缓冲溶液100mL中，加入 0.4 mg·mL－1的纤维素酶，室温下匀浆5 min，放置 1h后用三氯甲烷萃取 3次，每次100mL，合并三氯甲烷液浓缩并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，显色后测定吸光度，计算总甾体化合物的含量，结果见图1。由图1可以看出，在pH＜5时随着pH的增大，总甾体化合物的提取率显著提高，当pH为5.0时最高，之后随着溶液碱性增强而下降。溶液pH影响着纤维素酶活性，进而影响纤维素酶破壁效果及产物得率，pH最佳范围为4.0～5.0。

图1 pH对酶解的影响Fig.1 Effect of pH value on enzymatic hydrolysis

2.5.2 酶浓度对酶解的影响 分别称取葱白20 g，加纯化水 100mL，分别加入浓度为 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg·mL－1的纤维素酶，室温下匀浆 5 min，放置1h后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液浓缩并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，显色后测定吸光度，计算总甾体化合物的含量，结果见图2。由图2可以看出，随着酶浓度的增大，总甾体化合物的提取率逐步提高，当酶浓度为0.4 mg·mL－1时，总甾体化合物的提取率基本达到最大值，继续增大酶浓度，得率无明显上升趋势，适宜浓度为 0.3 ～0.5 mg·mL－1。

2.5.3 温度对酶解的影响 分别称取葱白20 g，加入0.4 mg·mL－1纤维素酶，分别加入温度为 30，40，45，50，55，60，70 ℃的纯化水 100mL，匀浆 5 min，并放置在相应的温度下，1h后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液浓缩并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，显色后测定吸光度，计算总甾体化合物的含量，结果见图3。由图3可以看出，在低温时，随着温度的升高总甾体化合物的提取率增大，在约50℃时达到最大值。纤维素酶通常在40～60℃下活性最高，温度过低会抑制酶的活性，过高却使酶蛋白变性失活，丧失催化能力。为使酶能保持较好的稳定性并发挥其活性，酶解适宜温度范围为45～55℃。

图2 酶浓度对酶解的影响Fig.2 Effect of enzyme concentration on enzymatic hydrolysis

图3 温度对酶解的影响Fig.3 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis

2.5.4 时间对酶解的影响 分别称取葱白20 g，加纯化水 100mL，并加入 0.4 mg·mL－1的纤维素酶，室温下匀浆 5 min 后，分别放置 0.5，l.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液浓缩并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，显色后测定吸光度，计算总甾体化合物的含量，结果见图4。由图4可以看出，随着酶解时间的延长总甾体化合物的提取率增大，在1.5 h时基本达到最大值。延长酶解时间可提高总甾体化合物的提取率，但2 h之后总提取率略有提高，说明酶解已基本完成，再延长时间势必增加能耗。

2.5.5 溶液体积对酶解的影响 分别称取葱白20 g，分别加纯化水 50，100，150，200，250，300mL，并加入0.4 mg·mL－1纤维素酶，室温下匀浆 5 min后，放置1h后用三氯甲烷萃取3次，每次100mL，合并三氯甲烷液浓缩并定容至100mL量瓶中，精密量取10mL蒸干，显色后测定吸光度，计算总甾体化合物的含量，结果见图5。由图5可以看出，在采用溶液体积为100mL时总甾体化合物的提取率达到最大值，继续增加溶液量提取率没有明显升高，且使用溶剂量较大也需要较大量的酶取样量，增加萃取使用三氯甲烷的量，因此为减少能耗及提取损失最终采用100mL的水作为20 g葱白的匀浆液。

图4 时间对酶解的影响Fig.4 Effect of time on enzymatic hydrolysis

图5 溶液体积对酶解的影响Fig.5 Effect of solution volume on enzymatic hydrolysis

2.5.6 正交实验 根据单因素实验，选择酶解 pH(A)、酶浓度(B)、酶解温度(C)、时间(D)为4个影响因素，每个因素分3个水平(表1)。根据L9(34)正交表进行实验，测定并计算总甾体化合物的含量。表2结果显示，影响葱白含总甾体化合物提取的各因素主次顺序是:酶解pH ＞酶解时间＞酶浓度＞酶解温度，最佳条件组合为:A3B3C2D3，即最佳提取工艺条件为:酶解 pH 为 5.0，酶浓度为 0.5 mg·mL－1，酶解温度为50℃，酶解时间为2 h。由表3可知，A、B、C、D 4个因素中酶解温度对葱白含总甾体化合物的提取效果没有显著性影响。

表1 正交实验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

3 讨论

酶是由生物体活细胞产生的一类特殊的生物催化剂，能够参与和促进活体细胞内的各种化学、生化反应。酶具有催化效率高、作用专一性强和催化条件温和等特点，酶技术应用于中药领域，可以提高中药有效成分的提取和分离效率，并且在中药有效成分转化上降低成本，提高转化水平及产量。根据药材植物细胞壁的构成，选择相对应的酶，将细胞壁的组成成分水解或降解，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取细胞内有效成分的目的[7]，常见可用于植物细胞破壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等。

表2 正交实验安排与结果Tab.2 Design and results of orthogonal test

表3 正交实验方差分析结果Tab.3 Results of variance analysis of orthogonal test

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，主要包含:内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷糖。纤维素酶具有分解纤维素，破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量及软化纤维素的作用。其酶解机制:首先由内切葡聚糖酶作用于纤维素的非结晶区，使其露出许多末端依次分解，纤维二糖水解酶从非还原区末端依次分解，产生纤维二糖，然后部分降解的纤维素进一步由内切酶和纤维二糖水解酶协同作用分解生成纤维二糖、三糖等低聚糖。最后再由β-葡萄糖营糖作用分解成葡萄糖[8]。

甾体化合物是葱白的主要成分之一[9]，采用硫酸-甲醇显色法[10-11]测定葱白中的甾体化合物具有灵敏度高、重复性好，且比色法相对高效液相色谱法具有操作简便、快速的优点，其准确度和测定结果的稳定性均能满足实验要求。

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