百合固金片质量控制

盛燕，陈浩，张文婷

(浙江省食品药品检验研究院，杭州 310004)

百合固金片由百合、地黄、熟地黄、麦冬、玄参、川贝母、当归、白芍、桔梗、甘草等10味中药组成，具有养阴润肺、化痰止咳的功效，用于肺肾阴虚、干咳少痰、咽干喉痛[1]。有本品批准文号的企业共2家，包装规格2种，分别执行国家食品药品监督管理局标准YBZ08222005-2009Z和YBZ13272009，检测方法不同，不能有效判别制剂的质量优劣。根据国家药典委员会关于2010～2011年度国家药品标准提高任务，笔者参考文献[2-4]，统一当归、玄参、白芍、甘草的薄层色谱(thin-layer chromatography，TLC)鉴别方法。芍药苷具抗炎、扩张血管、抗惊厥、免疫调节等作用[5-6]，建立高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法对芍药苷进行定量测定。结果表明，提高后的标准可操作性强、结果准确、重复性好，可统一作为2个厂家百合固金片的质量控制标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津(Shimadzu LC-20ADXR)系列液相色谱仪、安捷伦(Agilent 1100)系列液相色谱仪、戴安(Dionex U3000RS LC)系列液相色谱仪、CAMAG Reprostar 3数码成像系统(瑞士卡玛公司)。

1.2 试药 当归对照药材(批号:120927-200613)、哈巴俄苷对照品(批号:111730-200603)、甘草苷对照品(批号:111610-200604)和芍药苷对照品(批号:110736-200934，供含量测定用，含量以95.7%计)，均由中国食品药品检定研究院提供。硅胶G薄层板由青岛海洋、烟台、Merck公司提供。百合固金片由××××制药有限公司、××××药业有限公司提供;阴性样品由××××制药有限公司提供。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余为分析纯。

2 方法与结果

2.1 当归的鉴别 取本品20片(小片规格:每片0.4 g)或15 片(大片规格:每片0.45 g)，除去包衣，研细，加环己烷50mL，超声处理30 min，滤过，药渣备用，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材0.5 g，加环己烷20mL，同法制成对照药材溶液。取缺当归阴性样品8 g，同法制成阴性样品溶液。照TLC法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)实验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。6批样品均具当归对照药材的特征斑点，阴性样品无干扰，见图1。

图1 当归TLC图谱1.缺当归样品;2～7.供试品;8.当归对照药材Fig.1 TLC chromatogram of Angelicae sinensis Radix1.negative sample without Angelicae sinensis Radix;2-7.samples;8.reference herb of Angelicae sinensis Radix

2.2 玄参的鉴别 取当归薄层鉴别项下的药渣，挥干环己烷，加甲醇50mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水适量使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1 cm，柱高为15 cm)，先用水洗至洗脱液无色，再用15%乙醇50mL洗脱，弃去洗脱液，继用30%乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干备用，再用乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30mL使溶解，加浓氨试液1mL，摇匀，用水饱和的正丁醇60mL振摇提取，正丁醇提取液用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。取缺玄参阴性样品8 g，同法制成阴性样品溶液。另取哈巴俄苷对照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照TLC法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)实验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(12∶4∶1)的下层溶液为展开剂，预饱和15 min，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液(临用新配)，热风吹至斑点显色清晰。6批样品均具哈巴俄苷对照品的特征斑点，阴性样品无干扰，见图2。

2.3 白芍、甘草的鉴别 取玄参薄层鉴别项下30%乙醇洗脱液蒸干的残渣，加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。分别取缺白芍、缺甘草阴性样品8 g，同法制成阴性样品溶液。另取芍药苷和甘草苷对照品，分别加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照TLC法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验，吸取上述溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(12∶4∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰。6批样品均具甘草苷和芍药苷对照品的特征斑点，阴性样品无干扰，见图3。

图2 哈巴俄苷TLC图谱1.缺玄参样品;2.哈巴俄苷对照品;3～8.供试品Fig.2 TLC chromatogram of Harpagoside1.negative sample without Scrophulariae Radix;2.reference substance of Harpagoside;3 －8.samples

图3 甘草苷和芍药苷TLC图谱1.缺甘草样品;2.缺白芍样品;3.甘草苷;4.芍药苷;5～10.供试品Fig.3 TLC chromatogram of Liquiritin and Paeoniflorin1.negative sample without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma;2.negative sample without Paeoniae Radix alba;3.reference substance of Liquiritin;4.reference substance of Paeoniflorin;5 －10.samples

2.4 芍药苷的定量测定

2.4.1 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱为Agilent SB C18(250 mm × 4.6 mm，5μm)，柱温为30℃，流动相为乙腈-0.05%三乙胺溶液(用磷酸调节pH 至2.5)(14∶86)，流速为 1.0mL·min－1，检测波长为230nm，进样量为10μL。理论板数按芍药苷峰计应不低于4000。芍药苷与样品中其他组分分离良好;缺白芍阴性对照无干扰。色谱图见图4。

图4 阴性样品(A)、芍药苷对照品(B)和样品(C)HPLC色谱图1.芍药苷Fig.4 HPLC chromatograms of negative sample without Paeoniae Radix alba(A)，reference substance of Paeoniflorin(B)and sample(C)1.paeoniflorin

2.4.2 溶液的制备

2.4.2.1 对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每毫升含40μg的溶液，即得。

2.4.2.2 供试品溶液的制备 取本品20片，精密称定，研细，小片取约1 g，大片取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.2.3 阴性对照溶液的制备 取缺白芍阴性样品，按供试品溶液制备方法制备。

2.4.3 线性关系考察 精密吸取芍药苷对照品溶液(15.01μg·mL－1)1，3，5，10，20μL 和芍药苷对照品溶液(150.10μg·mL－1)5，10，16，20，25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量(ng)为横坐标，峰面积为纵坐标，得线性回归方程为Y=1236.1X+6746.8，r=0.9999(n=10)，结果表明，芍药苷在进样量15.01 ～3752.50 ng范围内呈良好线性关系。

2.4.4 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，按上述色谱条件测定芍药苷峰面积，结果峰面积平均值为3118772，RSD为0.09%，表明仪器精密度良好。

2.4.5 重复性实验 精密称取同一供试品6份，照供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件进样，测定，计算，结果芍药苷的平均含量为 5.96 mg·g－1，RSD为1.94%，表明本法重复性良好。

2.4.6 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液，于0，8.5，12.5，24.5，38，46 h 分别进样，按上述色谱条件测定芍药苷峰面积，结果峰面积平均值为3113561，RSD为0.32%，表明供试品溶液在46 h内稳定。

2.4.7 准确度实验 采用加样回收法，精密称取已知含量样品9份，分别精密加入芍药苷对照品适量，按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下测定，计算回收率，结果芍药苷平均回收率为103.3%，RSD=0.93%(n=9);结果见表 1。

表1 芍药苷加样回收率实验结果(n=9)Tab.1 Result of recovery tests of paeoniflorin

2.5 样品测定 取样品6批，按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下测定，计算，结果每片芍药苷含量分别为 2.24，2.61，2.79，1.00，1.05，1.04 mg。

3 讨论

建立TLC方法，供试品制备时，设计系统提取纯化方式，综合利用样品，简化操作步骤。比较不同的展开剂:当归鉴别采用环己烷-乙酸乙酯(9∶1)和正己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，玄参鉴别采用三氯甲烷-甲醇-水(12∶4∶1)的下层溶液和乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(12∶4∶1∶1)为展开剂，白芍和甘草鉴别采用乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(12∶4∶1∶1)和三氯甲烷-甲醇-水(12∶4∶1)的下层溶液为展开剂，均达到理想效果。比较不同厂家的硅胶G板:青岛海洋、烟台、Merck等均达到理想效果。比较不同的湿度:玄参鉴别在高湿环境下薄层效果明显下降，故在实验过程中应避免高湿;当归、白芍、甘草鉴别均达到理想效果。

建立HPLC法测定芍药苷，改进色谱条件，改善芍药苷的峰形和分离度。制备供试品溶液时，进行提取方法(超声和回流)，提取溶剂(70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇和甲醇)，称样量(0.5和1.0 g)及提取时间(20，30和40 min)的比较，最后选择最佳的制备条件。实验中还考察了仪器、色谱柱、柱温、流速、流动相pH值及流动相三乙胺浓度的变化对分离度等结果的影响，发现在测定条件下，系统的轻微变化对实验结果影响不大，系统耐用性良好。

笔者曾参考文献[3-4]，采用HPLC法在同一条件对白芍中芍药苷，甘草中甘草苷、甘草酸铵及玄参中哈巴俄苷的含量测定方法进行研究。比较不同梯度、不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.05%三乙胺溶液(用H3PO4调pH至2.5)等多种流动相，比较了Agilent SB-C18、Kromasil KR100-5 C18、shim-pack VP-ODS C18、phenomenex Luna C18等不同色谱柱，结果样品有干扰，分离度均不佳，耐用性较差，故未列入标准。

[1]YBZ08222005-2009Z，YBZ13272009，国家食品药品监督管理局标准[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:80，96，108，124.

[3]杨玲娟，赵晓莉，狄留庆，等.HPLC法测定芍药甘草汤总有效部位中4个活性成分的含量[J].中华中医药学刊，2007，25(3):522 －524.

[4]刘传统，祁红.和中利胆口服液的质量标准[J].中国药师，2011，14(8):1227 －1229.

[5]郑世存，李晓宇，欧阳兵，等.芍药苷药理作用研究新进展[J].中国药物警戒，2012，9(2):100 －103.

[6]李文艳，黄山君，王端.中药白芍的药理作用和质量控制研究进展[J].药学服务与研究，2012，12(2):118 －122.