近红外光谱法快速测定枇杷叶浸出物的含量*

李蕾蕾，林萍，王海霞，姬生国

(广东药学院中药学院，广州 510006)

枇杷叶来源于蔷薇科枇杷属植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.的干燥叶，是常用中药。研究表明其化学成分主要含有三萜酸类、挥发油类、黄酮类、多酚、倍半萜及糖苷类等[1]。《中华人民共和国药典》2010年版一部规定按醇溶性浸出物测定法(附录XA)项下的热浸法测定，用75%乙醇作溶剂，不得少于18%。但传统的浸出物测定方法操作复杂、费时费力，不能实现快速分析[2]。近红外光谱分析技术(near-infrared spectrum，NIRS)是一种方便、快速、无损的绿色分析技术，光谱特性稳定，信息量大[3]，已被广泛应用于谷物、石油化工产品、食品、纺织品、烟草等的分析测定[4-9]。近年来，NIR技术已经广泛应用到中药质量控制及道地性研究等方面，本课题组已经利用该技术对广陈皮、广藿香进行了定性及定量模型的建立[10－15]。笔者在本研究利用该技术建立枇杷叶浸出物含量的近红外定量模型，以期实现快速、准确测定枇杷叶药材浸出物含量。

1 材料

1.1 药材 2012年2月和11月期间分别采集于广东、湖北、河南、四川、浙江等省，经广东药学院中药学院姬生国教授鉴定为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.的干燥叶。枇杷叶药材经低温烘干后，粉碎过内径(850±29)μm(24目)筛为试验用样品，保存于自封袋中，置于干燥器中备用。

1.2 仪器 傅立叶变换近红外光谱仪，配有漫反射积分球、样品旋转器和石英样品杯、OMNIC光谱采集软件和TQ8.0分析软件(Nicolet 6700型，美国Thermo公司)。HH数显恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂)，万分之一天平(AY120，日本岛津公司)。

2 方法与结果

2.1 枇杷叶浸出物含量的测定方法 取样品粉末3 g，精密称定，置100～250mL锥形瓶中，精密加入75%乙醇50～100mL，密塞，称定质量，静置1h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定质量，用75%乙醇补足减失的质量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25mL，至已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量(%)。146批枇杷叶样品的醇溶性浸出物的含量在15.39% ～26.60%之间，且分布均匀。

2.2 近红外光谱的采集 取样品粉末4 g，混合均匀后放入石英样品杯，轻轻振摇使分布均匀。采用积分球漫反射测样，分辨率8 cm－1;扫描64次;扫描范围4000 ～12000 cm－1;温度(22.0 ±0.5)℃;相对湿度35%～40%。每批样品重复装样并扫描5次，求平均光谱。146批样品的近红外光谱叠加图见图1。

2.3 验证集与校正集的选取 将146批枇杷叶样品按照浸出物含量高低顺序进行排列，以4∶1的比例随机分为校正集和验证集，要保证验证集浸出物含量范围在校正集含量范围之内，使所选验证样品集更具代表性[16]。见表1。

2.4 光谱预处理 不同样品受颜色、颗粒大小的不均匀及杂散光等影响，将导致近红外光谱的基线漂移和光谱的不重复，因此，必须对原始光谱进行预处理。利用TQ8.0软件对样品光谱进行分析处理，采用偏最小二乘法(PLS)对校正集样品建立校正模型，同时作交叉验证，并用验证集样品对模型进行外部验证。以内部交叉验证决定系数(R2)、校正均方差(root-meansquare error of calibration，RMSEC)、预测均方差(rootmean-spuare error of prediction，RMSEP)为综合指标，考察不同预处理方法对模型建立的影响。其中，R2越接近1，说明样品分析值与近红外预测值相关性越好;RMSEC、RMSEP越小，说明模型的预测性能越好。最终确定最佳预处理方法为多元散射校正法(MSC)加二阶导数法(Second derivative)，见表2。其中，表2中二阶导数法所得结果R2最好，但RMSEC和RMSEP值相差较大，且主成分数出现过拟合，故不采用。

2.5 建模波段的选择 以 R2、RMSEC、RMSEP等为综合指标，考察不同建模波段对模型的影响，通过与其他波段的对比，明显看出在4057～10221 cm－1吸光度变化明显，信息丰富，确定此波段为最佳建模区间，见图2，表3。

2.6 主因子数的选定 在回归拟合模型建立时，主因子数对模型的稳定性有很大影响，主因子数过多会导致过拟合，过少则预测精度不够。本实验以校正集内部交叉验证均方差(root-mean-square root of crossvalidation，RMSECV)为优化参数，RMSECV越小，模型的预测精度越高，当RMSECV值最小时，所选主因子数最佳。本实验RMSECV最小值为1.83652，对应的最佳主因子数为8。见图3。

表1 校正集和验证集样品浸出物的含量分布Tab.1 Content distribution of the ethanol extracts from samples of calibration set and validation set %

表2 不同预处理方法对模型性能的影响Tab.2 Effect of different pretreatment methods on model performance

图2 样品的二阶导数光谱图Fig.2 The second derivative spectrogram of samples

2.7 校正模型的建立 运用TQ8.0定量分析软件中PLS法建立校正模型，图4为118份样品交互验证得到的NIR预测值与参考值之间的相关图，可以看出，校正集样品均匀地分布在回归线的两侧。经内部交叉验证得 RMSEC=0.387，R2=0.98428。图 5 为校正集样本与预测集样本的NIR预测值与参考值之间的绝对偏差图，可以看出，NIR测定值与药典法测定值之间的绝对偏差在±1.3之间。

表3 不同建模区间对模型性能的影响Tab.3 Effect of different spectrum range on model performance %

图3 RMSECV值随主成分的变化图Fig.3 Chart of RMSECV changes with main ingredients

图4 校正集样品交互验证得到的NIR预测值与参考值之间的相关图○校正集;+验证集Fig.4 Correlogram between NIR predicted values and reference value by cross validation of the calibration set samples○calibration;+validation

2.8 校正模型和验证 近红外光谱经过 MSC和Second Derivative处理后，在 4057 ～10221cm－1，选择前8个主成分建立了最优校正模型。该模型的R2=0.98428，RMSEC=0.387，RMSEP=0.659。以预测值与分析值的比值为预测回收率，28批验证集样品的平均预测回收率为99.55%。对于给定显著性水平0.05，t(0.05，28)=1.70，经配对 t检验，28个样品 NIR 预测值与热浸法测定值的t检验值为0.927，即两种方法的分析结果差异无统计学意义，该模型通过验证，可以准确预测其覆盖范围的枇杷叶中浸出物含量。见表4。计算得平均回收率99.55%。

图5 校正集样本与预测集样本的NIR预测值与参考值之间的绝对偏差图○校正集;+验证集Fig.5 Chart of the absolute deviation between NIR predicted values and references value of the calibration set samples and prediction set samples○calibration;+validation

3 讨论

在近红外光谱波长选择时，其中在4057～10221 cm－1波段中，5155 和6880 cm－1是水分子组合频吸收的两个谱带，主要包含药材中水分等有关信息，同时枇杷叶的主要化学成分三萜类、单环倍半萜类、黄酮类、多酚类、糖苷类等成分中含－OH基丰富，－OH基的倍频与合频的吸收带分别在6897和4831 cm－1[3]，故最终采用 4057 ～10221cm－1波段。

笔者利用近红外光谱技术结合化学计量法获得枇杷叶药材样品中的有效信息，通过与对应样品中浸出物的含量进行线性拟合而建立浸出物含量测定模型。传统的浸出物含量测定方法操作繁琐，耗时较长，需要大量试剂，且实验过程操作误差较大;本研究建立的测定方法，操作简便、测定速度快、对药材成分没有损害，可准确预测未知样品的浸出物含量。

表4 验证集样品的预测Tab.4 The prediction of validation set samples %

[1]李婷，林文津，徐榕青，等.枇杷叶的化学成分和药理作用研究进展[J].中国野生植物资源，2010，29(5):11－14，20.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:190.

[3]陆婉珍.现代近红外光谱分析技术[M].2版.北京:中国石化出版社，2006:35.

[4]周良娟，张丽英，张恩先，等.近红外反射光谱快速测定玉米DDGS营养成分的研究[J].光谱学与光谱分析，2011，31(12):3241 －3244.

[5]张宇佳，徐晓轩，宋宁，等.基于近红外漫反射光谱的烃源岩生烃潜量的确定[J].光谱学与光谱分析，2011，31(4):955－959.

[6]李晓云，王加华，黄亚伟，等.便携式近红外仪检测牛奶中脂肪、蛋白质及干物质含量[J].光谱学与光谱分析，2011，31(3):665 －668.

[7]杨敏，陈斌，桂家祥，等.变量优选在纺织品棉含量近红外分析中的应用[J].现代仪器，2012，18(2):23，28 －30.

[8]纪鹏，冯剑，李志伟.近红外分析技术在烟草行业的应用研究进展[J].安徽农业科学，2011，39(16):9848 －9850.

[9]万雯标，姜红.近红外光谱分析及其在药物原辅料分析中的应用[J].医药导报，2012，31(4):465 －470.

[10]蔡佳良，郭念欣，姬生国.不同干燥方法对广藿香中百秋李醇含量影响的近红外光谱分析[J].云南中医中药杂志，2013，34(1):53 －54.

[11]蔡佳良，李蕾蕾，姬生国.近红外光谱法快速测定广藿香中水分含量[J].药物制剂与药品质量控制，2012，31(11):1468－1470.

[12]蔡佳良，黄洁燕，邓婉婷，等.近红外光谱法快速测定广藿香中醇溶性浸出物含量[J].中国药学杂志，2012，47(24):2026－2028.

[13]蔡佳良，黄洁燕，李蕾蕾，等.运用近红外光谱法建立广藿香含叶量定量分析模型[J].中国现代应用药学，2013，30(3):260 －263.

[14]蔡佳良，郭念欣，黄洁燕，等.近红外光谱法建立测定广藿香中百秋李醇的定量模型[J].中国中药杂志，2012，37(14):2113－2116.

[15]郭念欣，蔡佳良，姬生国.近红外光谱技术在陈皮道地性分析中的应用[J].中国药房，2013，24(15):1394 －1396.

[16]章顺楠，杨海雷，刘占强，等.近红外光谱法在线监测复方丹参滴丸料液中有效成分含量[J].药物分析杂志，2009，29(2):192 －196.