双氯芬酸钠-β-环糊精聚合物缓释微球的制备与释药考察

王晓明，秦凌浩，郑丽娴，郑青，谭载友

(广东药学院药科学院，广州 510006)

环糊精聚合物(cyclodextrin polymer，CDP)是基于环糊精的聚合物，这种聚合物既能保持环糊精包结、缓释、催化和识别的能力，又兼具高聚物的特性，如良好的机械强度、较好的稳定性、环境敏感性、渗透扩散性和化学可调性等[1]。研究表明，CDP可以实现药物的缓释控释，且其增加水难溶性药物的溶解度、溶解速率和提高药物生物利用度的效果明显优于环糊精单体[2]。随着高分子科学的发展，环糊精聚合物已成为当今的热点研究方向之一。双氯芬酸钠(diclofenac sodium，DFS)为第2代非甾体解热镇痛抗炎药，具有使用剂量小、疗效高、起效快、不良反应少的特点[3]。但由于其在水中的溶解度很低，对胃黏膜的刺激性大，半衰期短而需频繁给药等缺点影响其广泛使用[4]。因此，本研究以 β-环糊精聚合物(β-CDP)为载体材料，制备双氯芬酸钠-β-CDP缓释微球，优化其制备工艺，并考察其释药特征，旨在降低其对胃黏膜刺激、减少给药次数，为以后进一步制成适宜的剂型提供前期工作基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-1810紫外-可见分光光度计(上海分析仪器厂)，Q600 SDT型热分析仪(美国 TAINC公司)，CS501型超级恒温器(重庆实验设备厂)，JJ-1型增力电动搅拌器(江苏省金坛市宏华仪器厂)，DZF-6020型真空干燥箱(上海迅博实业有限公司)，IX51光学显微镜(OLYMPUS BX-50)，S-520 Scanning Electron Microscope(日本HITACHI)，气浴恒温振荡器(江苏省金坛市宏华仪器厂)，KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 双氯芬酸钠对照品(中国食品药品检定研究院，批号:10334-0001)，双氯芬酸钠原料药(河南东泰制药有限公司，批号:110812，标示量98%)，β-CD[生化试剂，中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号:20100812]，环氧氯丙烷(epichlorohydrin，EPI，分析纯，天津福晨化学试剂厂，批号:20110302)，无烟煤油(天津亿茂化工集团，批号:20120608)，司盘80(化学纯，天津市大茂化学试剂厂，批号:20110801)，聚山梨酯20(化学纯，天津市福晨化学试剂厂，批号:20110317)等。

2 方法与结果

2.1 β-CDP空白微球的制备 根据文献[5]，精密称取β-CD12 g，加入适量40%氢氧化钠溶液，加热溶解。在30℃、恒速搅拌下，缓慢滴加 EPI 12.5mL，反应1.5 h。在高速搅拌下，加入含有混合乳化剂(司盘80∶聚山梨酯20=3∶1，即司盘80为1.2 g、聚山梨酯20为0.4 g)的煤油 80 g，10 min后降低搅拌速度至800 r·min－1，升温至50℃，继续搅拌反应6 h。反应结束后，静置30 min，倾去上层油相，将产品抽滤，并依次用稀盐酸、乙醇、纯化水、丙酮充分洗涤后抽干，以除去各种杂质。置于通风橱内于室温下晾干，然后用真空干燥箱于60℃下干燥至恒重，即得β-CDP空白微球。

2.2 β-CDP载药微球(DFS-β-CDP)的制备 取 DFS适量，溶解于无水乙醇20mL中，然后加入经干燥的β-CDP空白微球(MS)1 g，于一定温度下浸泡若干小时。载药结束后，冷却至室温，用纯化水冲洗微球表面，抽干，于60℃下真空干燥至恒重，即得载药微球。本研究通过正交设计对药物溶液浓度、载药温度、微球与药物质量比、载药时间4个因素进行考察，每个因素取3个水平(表1)。选择L9(34)的正交实验表进行实验，以载药率(C，%)(S1)和包封率(En，%)(S2)的综合评分指标(S)为评价指标，根据 S=0.3(S1/S1最大)+0.7(S2/S2最大)计算，对结果进行分析。实验结果和方差分析见表2和表3。表2的极差分析结果表明:4个因素对微球综合评分指标的影响顺序是:A＞B＞C＞D，即DFS浓度＞载药温度＞微球与药物质量比＞载药时间。从表3的方差分析可以看出，DFS浓度对实验结果具有显著性影响(P＜0.05)。综合考虑载药率与包封率，又要降低工艺成本，最终确定制备DFS-β-CDP微球的最佳工艺条件为A3B2C1D1，即DFS浓度为30%，载药温度45℃，微球与药物质量比为1∶1，载药时间24 h。

2.3 制备工艺的验证 通过对上述最佳处方工艺进行验证实验，制备6批DFS-β-CDP微球，确定在该条件下制得的微球载药率为(12.384±0.214)%、包封率为(45.372±2.121)%(n=6)，说明所确定的最优工艺条件稳定，重复性好。

表1 L9(34)因素水平表Tab.1 Factors and levels of the orthogonal test

表2 正交设计与实验结果Tab.2 Design and results of the orthogonal test

表3 综合指标方差分析Tab.3 Variance analysis of comprehensive index

2.4 DFS-β-CDP微球载药率及包封率的测定 采用紫外-可见分光光度法测定微球的载药率及包封率。具体操作如下:精密称取DFS-β-CDP微球50 mg，研细，置于100mL量瓶中，加入2mmol·L－1氢氧化钠适量，超声30 min，加2mmol·L－1氢氧化钠溶液定容，摇匀。经孔径0.45μm微孔滤膜过滤后用分光光度计于276nm处测定吸光度(A)。根据已测得的标准曲线方程(精密称取DFS对照品 25 mg，置于100mL量瓶，加入2mmol·L－1氢氧化钠溶解并定容。分别吸取1，2，3，4，5mL于50mL量瓶，加2mmol·L－1氢氧化钠溶液定容，摇匀。用分光光度计于276nm处测定吸光度(A)。以A值对质量浓度(ρ)进行线性回归，得回归方程A=0.0327ρ +0.0546，r=0.9997(n=6)。求得 DFS 的含量，并按照以下公式计算载药率及包封率。载药率(%)=微球中实际药量/微球总量×100%;包封率(%)=微球中实际药量/投药量×100%。

2.5 DFS-β-CDP 微球的结构表征

2.5.1 微球粒径大小及表面形态 采用光学显微镜观察微球的粒径分布，平均粒径为(99.47±3.50)μm，跨距为(1.00±0.21)μm(n=6)。使用扫描电子显微镜观察微球的表面形态和分散性。结果表明，制得的DFS-β-CDP微球表面光滑而圆整，形态见图1。

2.5.2 热分析 微球中药物和聚合物的形态以及相互作用对微球载体的性能有很大影响。药物与聚合物的亲和性不同，体现在二者之间存在的相互作用。本研究用美国TAINC公司的Q600 SDT型热分析仪测定了下列样品的热重分析(thermogravimetry analysis，TGA)和差热分析(differential scanning calorimetry，DSC):DFS、β-CDP 微球、DFS-β-CDP 微球，考察双氯芬酸钠制成微球后的热稳定性。具体步骤:将样品研成细粉，称取5～10 mg置于样品池中。以相同的空白坩埚为内置空白，实验在氮气(N2)气氛中(流速为20mL·min－1)进行，升温范围20～500℃，控制升温速率为5℃·min－1。分别测定3种样品的TGA-DSC曲线，结果见图2。由图2可知，对于DFS，在276.44℃处的熔融峰表明药物的晶体形态。β-CDP微球开始分解温度为275℃，当温度高于455℃后，总失重达80.66%，之后基本不再随温度变化，失重可能是由聚合物中环氧氯丙烷的挥发所致;而DFS-β-CDP微球具有一个全新的热分析图谱，开始分解的温度为250℃，当温度高于485℃后，总失重达80%，之后基本不再随温度变化;且整个图中不存在双氯芬酸钠的熔融峰，这表明药物以无定形的状态分散在聚合物载体中。由此说明，双氯芬酸钠制成微球后，其与β-CDP之间存在着较强的相互作用，并具有良好的热稳定性[5]。

图1 DFS-β-CDP微球的扫描电镜照片Fig.1 Scanning electron microscopy picture of DFS-β-CDP MS

2.6 体外释放度考察

图2 DFS(A)、β-CDP微球(B)和DFS-β-CDP微球(C)的热重分析和差热分析Fig.2 Gravitational thermal analysis and thermal differential analysis of DFS(A)，β-CDP microsphere(B)and DFS-β-CDP microsphere(C)

2.6.1 测定波长的确定 ①对照品溶液的制备:取DFS对照品适量，置于100mL量瓶中，以少量乙醇溶解后用pH6.8磷酸缓冲液稀释至刻度，摇匀备用。②辅料溶液的制备:取空白微球适量，加入少量乙醇，超声30 min后经孔径0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液置于100mL量瓶中并用 pH6.8磷酸缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)稀释至刻度。照《中华人民共和国药典》2010版二部附录ⅣA分光光度法，在200～400nm波长内扫描，结果见图3。由图3可知，DFS在276.5nm处有最大吸收，而空白微球在此处几乎无吸收，可见其对药物的测定无干扰，故选择276.5nm作为检测波长。

图3 β-CDP微球(A)和DFS(B)的紫外扫描图谱Fig.3 UV scanning spectrum of β-CDP microsphere(A)and DFS(B)

2.6.2 标准曲线的制备 精密称取对照品适量，用pH6.8PBS配制成一系列不同浓度的对照品溶液。在276.5nm波长处测定吸光度(A)，以A值对质量浓度(ρ)进行线性回归，得回归方程:A=0.032ρ +0.0102，r=0.9999，(n=6)。结果表明，DFS在5 ～25 mg·L－1的浓度范围内，吸光度与质量浓度线性关系良好。

2.6.3 精密度考察 分别配制低、中、高3种浓度的对照品溶液，测定A值，按照回归方程计算实测浓度，考察方法的日内变异和3 d的日间变异，日内RSD值分别为 0.78%，0.57%，0.43%，日间 RSD 值分别为0.66%，0.27%，0.21%(n=6)。结果表明方法的精密度良好。

2.6.4 稳定性考察 取对照品溶液及供试品溶液，分别于0，1，2，4，8 h 进行 A 值测定，考察样品的稳定性。结果在8 h内对照品溶液与供试品溶液A值的RSD值分别为0.40%，1.23%(n=6)。结果表明样品溶液在8 h内测定稳定性良好。

2.6.5 回收率测定 精密称取干燥至恒重的DFS 20，25，30 mg，置于100mL 量瓶中，加 pH6.8PBS 适量使完全溶解，再分别加入粉碎后的空白微球 60，75，90 mg，超声30 min后经孔径0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液稀释至适当浓度后，于276.5nm波长处测定A值，代入标准曲线方程计算样品的回收率。结果表明方法的平均回收率为98.74%，RSD=0.52%(n=6)。

2.6.6 释放度的测定 精密称取载药微球适量，置于透析袋中，加入释放介质2mL，扎紧透析袋，悬浮于具塞玻璃瓶中。透析袋外加入pH6.8 PBS 98mL。置于气浴恒温振荡器中，温度保持(37±1)℃振荡，定时取出释放介质5mL，同时补充同体积介质。释放液经孔径0.45μm微孔滤膜过滤，在276.5nm 波长处测定 A值，计算药物累积释放百分率。

2.6.6.1 不同载药量对微球体外释放的影响 图4为不同含药量下DFS-β-CD微球的释放曲线。由图4可见，随着药物含量的增加，释放速率略有降低。

2.6.6.2 不同粒径对微球体外释放的影响 图5为不同粒径的DFS-β-CD微球在pH6.8PBS中的释放曲线。从图5中可以看到，释放曲线随着粒径的增大而降低。较小粒径的微球由于扩散路径较短，且扩散时的比表面积较大，因此药物的释放速率较高。由此可见，改变粒径大小可以作为控制药物释放速率的有效手段。

2.6.6.3 透析袋内介质的体积对微球体外释放的影响 为考察透析袋内释放介质对微球释药速度的影响，本研究使透析袋内释放介质的体积V2分别为:2mL、7mL和8mL，而透析袋外释放介质的体积V1为(100－V2)mL，释药结果见图6。由图6可知，透析袋内释放介质的体积对DFS-β-CDP微球的释药速度有一定的影响。开始阶段，3种情况相差不大;随后，随着透析袋内释放介质体积的增大，释放速率略有增大，这主要是因为随着透析袋内溶液体积的增加，微球溶胀后袋内溶液的黏度降低，使得药物的溶解速率增大。同时说明，药物从袋内向袋外扩散的速率与袋内药物溶液的浓度无关。

2.6.6.4 不同pH值对微球体外释放的影响 为考察不同pH值释放介质对微球释药速度的影响，本研究使透析袋内释放介质的体积V2为2mL，透析袋外释放介质的体积V1为98mL。DFS-β-CDP微球在不同pH的PBS中的释放曲线见图7。结果表明，溶液的pH对药物的释放速率影响很大，释放速率随着pH的增大而加快，这是由于双氯芬酸钠的溶解度随pH的增大而增大的缘故。

2.6.7 药物释放的模型拟合 反复测定最佳工艺条件下制得的DFS-β-CDP微球在pH6.8 PBS中的释放曲线，结果见图8。如图所示，最佳工艺条件下制得的DFS-β-CDP微球无明显的突释现象，到24 h药物才基本释放完全。以零级、一级动力学方程、Higuchi方程进行拟合，结果表明药物释放行为符合一级动力学方程 ln( 1 －Q)= －0.0716 －0.0822t(r=0.9927)。这说明，DFS经聚合物微球的包载后具有明显的缓释效果，原因在于它能与β-CDP微球的网状孔隙及β-CD的空腔充分地嵌合，主客体之间的结合力较强。此外，图9为微球释药前后的扫描电镜图片。由图可见，释药后微球表面粗糙、疏松多孔，可见，这些孔道的存在是药物扩散的主要通道。释放后的微球形状仍然保持完整的球形，因此可以判断，当以pH6.8 PBS为释放介质时，β-CDP微球未发生溶蚀、降解等。

图8 DFS-β-CDP微球的累积释放曲线(n=6)Fig.8 Cumulative release curve of DFS-β-CDP MS(n=6)

图9 DFS-β-CDP微球释放前后的扫描电镜照片A.释放前;B.释放后Fig.9 SEM picture of DFS-β-CDP before release and after releaseA.before release;B.after release

3 讨论

本研究以β-CD为原料、EPI为交联剂、并以水相作为分散相、有机相煤油作为连续相、司盘80和聚山梨酯20为乳化剂，在强碱性条件下，采取反相聚合技术制备药物控制释放载体β-CDP微球。该技术具有聚合速率高、聚合物分子量高、得到的乳胶通过调节体系的pH或加入适当乳化剂的方法能使聚合物迅速地溶于水等优点。

本研究通过正交设计，确定制备DFS-β-CDP缓释微球的最佳工艺条件为:DFS浓度30%，载药温度45℃，微球与药物质量比为1∶1，载药时间24 h。微球的体外释放可以很好地用缓释模型进行拟合。

体外释放影响因素考察结果表明，不同的pH、袋内释放介质体积、载药率和粒径对药物的释放有明显影响，其中粒径的影响最大。事实上，影响微球释放速率的其他因素很多，包括微球的致密性、药物在微球中的分散水平、组分间的亲和作用等，它们对药物的溶出和扩散都有影响，微球性质的变化是这些因素的综合结果。

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