RP-HPLC法测定药材黑豆中大豆苷的含量

上海海天医药科技开发有限公司（200023）陆泉

黑豆为豆科植物大豆Glycine max ( L. )Merr.的干燥成熟种子，全国各地均有栽培，主产于山西、河北、陕西[1]，享有“豆中之王”的美誉。黑豆其性甘味平，色泽较黑，归脾、肾经。主要具有益精明目，养血祛风，利水解毒的作用[2]。黑豆含有多种化学活性成分，主要为黄酮类、多糖、色素、皂苷等[3]。2010年版中国药典中黑豆以大豆苷为对照品进行药材鉴别。大豆苷为黄酮类成分，具有抗癌、抗氧化、调节免疫、防辐射、预防骨质疏松等多种药理作用[4]。黑豆药材中大豆苷的含量测定文献报道较少[5]。本文采用RPHPLC法测定了不同产地黑豆中大豆苷的含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20AD高效液相色谱仪（日本SHIMADZU），SPD-M20A紫外检测器（日本SHIMADZU）。BT125D十万分之一分析天平（德国Sartorius），sk250h型超声仪（上海科导超声仪器有限公司），FZ-102型台式药材粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）。

1.2 材料 大豆苷标准品（购自中国药品生物制品检定所，批号：111738-200501），甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA），娃哈哈饮用纯净水，其余试剂（分析纯，市售）。黑豆药材3批，均为市售品，经安徽农业大学植物学教研室何金铃教授鉴定为豆科植物Glycine max (L.)Merr.的干燥成熟种子。

2 方法与结果

附图 大豆苷标准品（A）与样品（B）的HPLC图

附表1 加样回收率试验结果（n = 9）

附表2 黑豆药材中大豆苷的含量测定结果（n = 3）

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：cosmosil-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm），流动相：乙腈-0.1 %三氟乙酸溶液（12∶88， v/v）；柱温：25℃；流速：1mL/min；检测波长：254nm；进样量10 μL。大豆苷在此色谱条件下的保留时间为9.84 min，分离度＞1.5，按大豆苷计算理论塔板数＞4000，色谱峰对称因子在0.95～1.05之间。色谱图见附图。

2.2 标准品溶液制备 取干燥至恒重的大豆苷标准品约5.55 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得111.0 μg/mL的大豆苷标准品储备液。

2.3 供试品溶液制备 黑豆干燥药材（产地1）粉碎过筛，取药材粉末约1.5 g，精密称定，置100 mL平底烧瓶中，加入甲醇50 mL，超声提取3次，每次30 min。合并提取液，旋蒸至干，残渣定量转移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤即得供试品溶液。

2.4 线性关系的考察 精密吸取大豆苷标准品储备液 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 置 10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得大豆苷系列标准溶液，在上述色谱条件下，分别进样分析，进样量10 μL，记录峰面积。以标准品峰面积（Y）为纵坐标，标准品浓度（X，μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。得大豆苷回归方程：Y=4959227.96X-16409.98 ( R=0.9999 )。结果表明，大豆苷在1.11～88.8 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取大豆苷标准品溶液（5.55 μg/mL），在上述色谱条件下，连续进样6次，进样量10 μL，测定峰面积，标准曲线法计算含量。大豆苷标准品溶液的RSD为0.35 %。结果表明，仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取黑豆干燥药材粉末（产地1），按“供试品溶液制备”项下操作平行制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下，进样量10 μL，测定峰面积，标准曲线法计算含量。供试品溶液（产地1）大豆苷的RSD为1.14 %，结果表明，该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取大豆苷供试品溶液，避光放置，在上述色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、24 h进样分析，进样量10 μL，测定峰面积，标准曲线法计算含量。大豆苷供试品溶液的RSD为0.64%，结果表明，大豆苷在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 取黑豆干燥药材粉末（产地1）约0.45 g（大豆苷的含量为288.9 μg/g），共9份，精密称定，分别加入相当于原药材大豆苷含量50%、100%、150%的大豆苷标准品溶液，每浓度3份。按“供试品溶液制备”项下操作，并在上述色谱条件下进样分析，进样量10 μL，测定峰面积，标准曲线法计算含量。根据加样回收率公式，计算加样回收率，结果见附表1。大豆苷平均回收率为99.99 %，RSD为1.45 % ( n = 9 )，结果表明，该方法准确度良好。

2.9 样品含量测定 取各产地黑豆干燥药材粉末，按“供试品溶液制备”项下操作，并在上述色谱条件下进样分析，进样量10 μL，测定峰面积，标准曲线法计算大豆苷含量，结果见附表2。

3 讨论

黑豆是黑色食品中的重要一员，有着独特的营养和药用价值，在药品和食品行列中均占有非常重要的位置。我国黑豆资源较为丰富，随着人们对黑豆营养和药用价值的逐渐认识和对黑豆的成分与药理作用关系的深入研究，黑豆的开发利用前景将会更加广阔。

黑豆为《中国药典》2010年版新加入品种，但药典中尚无含量测定项。本文建立了黑豆药材中大豆苷含量测定的RPHPLC法，方法简单可行，重复性好，结果准确可靠，为完善黑豆药材质量标准提供参考。