新型抗癫痫药瑞替加滨的遗传毒性杂质的控制

天津市汉康医药生物技术有限公司(300203)刁荣蓉 刘立明 张曼 孙影倩 侯俊

关键字：瑞替加滨；液相色谱-串联质谱法；遗传毒性杂质

瑞替加滨是一种口服起效的钾离子通道开放剂，由葛兰素史克和Valeant制药公司共同研发生产。于2011年3月经EMEA批准在欧洲上市，商品名：Trobalt®；于2011年6月经FDA批准在美国上市，商品名为Potiga®。适用于18岁及以上成人癫痫部分性发作的辅助治疗。

本品是一种具有新作用机制的抗癫痫药。研究证实，瑞替加滨的作用与电压门控型钾离子通道（KCNQs）有关，其中作用于KCNQ2/3通道调节M型钾电流（[Ik（M）]）是其主要的作用机制[1][2][3]。瑞替加滨的抗痫机制决定了其作用特点有别于其他抗癫痫药物，这不是作用于神经元的N -甲基- D-天冬氨酸（NMDA），亦不能阻断神经元钠离子电流的内向钾电流和混合性钙离子电流，而是通过激活γ-氨基丁酸（GABA）[4]诱导的电流而起作用。

根据EMEA公布的遗传毒性杂质的警示结构，瑞替加滨具有苯胺基结构，原研厂家对本品进行了小鼠骨髓的微核实验以及大鼠肝细胞的体内/体外UDS实验，结果显示为阴性，在非临床研究的Ames试验中，研究显示当杂质含量降低到限度阈值以下时，Ames试验则显示为阴性，因此瑞替加滨无遗传毒性，但通过研究发现，本品在合成过程中也涉及苯胺基结构的杂质，为了将其控制在限度阈值以下，我们进行了研究。

附图1 乙基（4-{[4-氟苯基）甲基]氨基}-2-硝基苯基)氨基

附图2 乙基（4-{[(1E)-(4-氟苯基)亚甲基]氨基}-2-硝基苯基）氨基

1 根据合成工艺分析，本品中可能含有如下遗传毒性杂质

1.1 杂质1 乙基（4-{[4-氟苯基）甲基]氨基}-2-硝基苯基)氨基，见附图1。

1.2 杂质2 乙基（4-{[(1E)-(4-氟苯基)亚甲基]氨基}-2-硝基苯基）氨基，见附图2。

附图3 杂质线性试验

1.3 上述杂质由于其含有苯胺基结构而可能具有遗传毒性，因此按照EMEA《遗传毒性杂质限度指导原则》要求，瑞替加滨最大日剂量为1.2g/天，毒理学担忧阈值(TTC)为1.5μg/天，故本品遗传毒性杂质的杂质限度应为(1.5μg/天)/(1.2g/天)=1.25ppm，因此我公司制定了遗传毒性杂质的检测方法，已将其控制在该限度一下。

2 测定方法

2.1 仪器 安捷伦G6410A 三重四级杆液质联用仪。

2.2 质谱条件

①检测方式：正离子检测方式；②离子源：电喷雾离子化源；③离子源喷射电压：4.0kV；④毛细管温度 (℃)：325；⑤辅助气流速： 45；⑥扫描方式：一级全扫描方式，二级全扫描方式；⑦色谱柱：Waters RP18 5μm， 4.6 x 150mm Column。

附表1 线性试验结果

附表2 杂质2回收率试验结果

附表3 杂质2回收率试验结果

附表4 液相梯度

2.3 液相梯度 见附表4。

3 试验

3.1 定位试验 精密称取瑞替加滨与杂质1、2适量，配制杂质混合溶液，注入液相色谱仪，进行LC-MS/MS试验[5]，由混合溶液图谱可知，各通道均可良好检出，瑞替加滨主峰保留时间为6.3min，两杂质1、2的保留时间分别为7.4min和8.3min，主成分与杂质峰分离良好。

3.2 线性试验 精密称取杂质1、2各10mg，置同一100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为储备溶液，精密量取储备溶液，加乙腈稀释制成每1ml中约含上述杂质2ng、4ng、6ng、8ng、10ng的溶液，作为溶液①、②、③、④、⑤，分别精密量取上述溶液各5μl注入液相色谱仪，进行LC-MS/MS试验，记录色谱图，见附图3，附表1。由以上试验可知，上述杂质在浓度在0～10ng/ml中线性关系良好。

3.3 检测限试验 取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取5μl注入液相色谱仪，进行LCMS/MS试验，记录色谱图。各杂质检测限浓度均为0.6ng/ml。相当于0.2ppm的杂质可检出。

3.4 回收试验 精密量取储备溶液适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含杂质1、2 各32、40、48ng的溶液，作为储备溶液，平均制备三份，精密量取1ml，置10ml量瓶，分别加入瑞替加滨32mg，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，分别精密量取5μl，注入液相色谱仪，进行LC-MS/MS试验，以测得量/添加量×100%计算回收率，结果各杂质回收率良好。见附表2，3。

4 结论

该方法测定瑞替加滨的遗传毒性杂质可行，且经检测本品中杂质1、2均未检出，说明我公司合成的原料药遗传毒性杂质符合限度要求。