高效液相色谱法测定防风中色原酮的含量

北京医药集团职工大学（100079）项瑞

防风为伞形科植物防风 Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk 未抽花茎的干燥根，春、秋二季采挖未抽花茎植株的根，除去泥沙及须根，晒干。主产地为黑龙江、吉林、河北、辽宁等地。始载于《神农本草经》，列为上品，辛、甘，微温，归肝、脾、膀胱经，具有解表散风、祛风止痉及胜湿止痛等功效，主治周身尽痛、外感风寒、头痛目眩、风寒湿痹，骨节疼痛、四肢挛急等证，是中药复方的重要组成之一，广泛应用于中医临床。防风中主要化学成分主要是色原酮类，挥发性成分，香豆素类，多糖等。高效液相色谱法准确、可靠，操作简便，可有效应用于防风的质量控制[1][2]。

1 仪器与试剂

岛津LC-20A高效液相色谱仪（岛津国际贸易（上海）有限公司）；色谱柱：Diamonsil（R）钻石C18（250mm×4.6mm），5μm；KQ3200DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。BS-110S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），AE240METTLER（梅特勒-托利多）。

升麻素苷对照品（批号111522～200406）、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（批号111523～200405），均购自中国药品生物制品检定所，纯度供含量测定用。防风饮片购自安国市药材市场（经北京中医药大学陈玉婷老师鉴定为防风正品），乙腈为色谱纯（Fisher Scientific），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），其他试剂均为分析纯（北京北化精细化学品有限责任公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil 钻石C18（250mm×4.6mm），5μm；流动相：乙腈-0.1%磷酸(18∶82)；检测波长：254nm；流速：1mL/min。标准品及样品HPLC色谱图见附图1～3。

附图1 升麻素苷标准品

附图2 5-O-甲基维斯阿米醇苷标准品

附图3 防风细粉HPLC色谱图

附图4 升麻素苷标准曲线

附图5 5-O-甲基维斯阿米醇苷标准曲线

附表1 升麻素苷线性关系考察

附表2 5-O-甲基维斯阿米醇苷线性关系考察

附表3 精密度实验

附表4 重复性实验

附表5 稳定性实验

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取升麻素苷对照品1.42mg，5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品1.76mg，分别加甲醇溶解至25mL量瓶中，定容并摇匀，制成含升麻素苷0.0568mg/mL的对照品溶液，含5-O-甲基维斯阿米醇苷0.0704mg/mL对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液 取本品细粉约0.2克，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，称定重量，超声40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 标准曲线的制备 分别精密吸取升麻素苷（0.0568mg/mL）对照品溶液、5-O-甲基维斯阿米醇苷（0.0704mg/mL）对照品溶液 0.2、5、10、15、20μL，按上述色谱条件测定峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标，分别以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的量为横坐标进行线性回归，其回归方程分别为：Y=1760119.1248X+7637.3464，r=0.9998；Y=2059780.5679X-2149.6618，r=0.9999可见，升麻素苷在0.01136～1.136μg范围内，5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.01408～1.408μg具有良好的线性关系。见附表1～3；附图4，5。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 制备同一供试品溶液，连续进样5次，升麻素苷峰面积RSD＝0.05%，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积RSD=0.78%，见附表3。结论显示仪器精密度良好。

附表6 升麻素苷加样回收率表

2.4.2 重复性实验 取细粉约0.2克，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，称定重量，超声40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。平行5份测定，RSD分别为2.73%、0.80%，结果见附表4。显示该方法重复性较好。

2.4.3 稳定性实验 制备供试品溶液1份，分别于配制后0、2、4、6、24h测定，升麻素苷峰面积RSD＝1.13%，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积RSD=0.88%，结果见附表5。显示供试品溶液在24h内基本稳定。

2.4.4 加样回收率实验 采用加样回收法，分别精密称取已知含量的同一批样品0.08g，平行10份，5份精密加入升麻素苷对照品溶液（0.0568mg/mL）4mL，另5份精密加入5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（0.0704mg/mL）2.5mL，测定并计算升麻素苷的平均回收率为102.39%，RSD＝2.78%；5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均回收率为99.68%，RSD=2.17%，n=5。表明该法加样回收率合格。结果见附表6， 7。

2.5 防风药材含量测定 依照《中国药典》2010版一部防风项下含量测定方法测定所购防风的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷总含量，结果见附表8。显示本批防风药材中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷总含量符合药典规定。

3 讨论

附表7 5-O-甲基维斯阿米醇苷加样回收率表

附表8 防风药材含量测定结果

3.1 用紫外分光光度计测定对照品溶液和样品溶液，发254nm处升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷吸收较强，干扰少，故选择此波长为检测波长。

3.2 比较了药典[3]所载甲醇-水系统与本实验乙腈-水系统作为流动相进行试验，发现乙腈-水系统作为流动相升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的峰形好，保留时间适中，柱效高。

3.3 本试验用高效液相色谱法对防风中的升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷同时定量，可以更科学、准确地控制药材质量。