重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液治疗慢性乙型肝炎受试者后血清中和抗体检测

首都医科大学附属北京佑安医院（100069）贾敏 王立清 段瑾 陈曦 盛艾娟 王美霞

北京杰华生物技术有限责任公司（100102）吕秋军 徐静 王宝亮 梁屹

重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液（乐复能）是由北京杰华生物技术有限责任公司自主研发成功，系采用基因穿梭法，从12种人α干扰素基因构建杂交文库，采用高通量筛选技术，筛选10多万个克隆而得到的高活性新型蛋白，由498个核苷酸编码、166个氨基酸组成，分子量为19.3kD，已经取得美国专利。乐复能在临床上准备开发用于治疗慢性乙型肝炎（CHB），2009年获得SFDA新药临床研究批件，于2010年3月正式启动试验，2011年11月完成所有受试者的治疗与随访观察。

该临床试验设计成3组，共入组24例受试者。研究性治疗期：6周～7周。第1组“第1日，10μg/次，1次/日；第2～7日，停药；第2周～第7周，10μg/次，1次/日；入组8例受试者，脱落1例”；第2组“第1～6周，10μg/次，每周3次（隔日1次）；入组6例受试者”；第3组“第1周，10μg/次，1次/日；第2～6周，20μg/次，每周3次（隔日1次）；入组10例受试者”。各剂量组给药途径均为肌肉注射。

近年来，随着大量生物技术药物的研发，免疫原性的评价成为阐明这些药物临床安全性和有效性的关键因素[1]。中和抗体的活性是免疫原性的重要评价指标，会中和药物的活性，影响药物的清除、血浆半衰期和组织分布，改变药效/药动学，使在非临床研究中观察到的效应，可能并非药物真正的药理和/或毒性反应，因此在评价药物安全性时同时考察中和抗体活性非常必要。世界卫生组织从1983年[2][3][4]开始推荐使用 Kawade 等人[5][6][7]创立的细胞病变效应实验作为检测α、β干扰素中和抗体的方法，此法目前广泛采用。这次乐复能乙肝临床试验血清样品检测即遵循Kawada创立的细胞病变效应（Cytopathic effect）方法，即10倍减少单位（Tenfold reduction Unit， TRU）中和滴度法。

1 材料

1.1 试验用药 重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液(北京四环生物制药有限公司，规格2 0μg·m l-1，批号20090601/20100101/20110303)；重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液原液（北京杰华生物技术有限责任公司，蛋白含量1.08mg·mL-1，批号01/P101206）。

1.2 样品 待检样品（乐复能临床试验佑安医院受试者43天或50天抗药抗体阳性血清）；阴性对照血清（本实验室2位志愿者的血清）。

1.3 试剂与耗材 WISH细胞（购自中国药品生物制品检定所，液氮保存）；V S V水泡性口炎病毒（购自中国药品生物制品检定所，液氮保存）；MEM培养基（GIBCO，Cat.No. 41500-034，2℃～8℃保存）；Penstrep（GIBCO，Cat.No. 15140-122，2℃～8℃保存）；0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO，Cat.No.25200-056，2℃～8℃保存）；FBS胎牛血清（GIBCO，Cat.No. 10099-141，-20℃保存）；NaHCO3（Sigma，Cat. No. S7795-500G）；结晶紫（崇明县裕西试剂厂）；无水乙醇（北京化工厂）；醋酸（北京化工厂）；单条可拆酶标板（Nunc，Cat.No.468667）；96孔U型细胞培养板(Nunc，Cat.No. 163320)。

1.4 仪器 酶标仪（VERSAmax，美国Molecular Devices）；水浴锅（北京市医疗设备厂，型号 GSY-Ⅱ）；旋涡混匀器（德国IKA，型号 VG3 S25）；超净工作台（苏净安泰，SW-CJ-ZFD）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂，XDS-1B）；CO2培养箱（日本SANYO，MCO-15AC）；12道移液器（美国eppendorf，型号 30～300μl）。

2 方法与结果

2.1 第1天 细胞制备

2.1.1 将WISH细胞，用0.25%Trypsin-EDTA消化后加入完全培养液吹均匀，制成浓度为1.8～2.2×105个·ml-1的单细胞悬液，加入96孔细胞培养板中，每孔0.1ml，5% CO2，37℃，培养18～24小时。

2.1.2 将待检血清56℃ 30分钟灭活（水浴），备用。

2.2 第2天 样品稀释

2.2.1 待检样品 在稀释板上用样品稀释液（含10 LU·ml-1乐复能的完全培养基。根据Kawade法，如果多于或者少于10倍实验室单位，均有可能造成最终结果的偏差；在多次预实验中，乐复能在本实验中的实验室单位（LU）是2pg·ml-1。）稀释灭活后的待检血清用样品，从1∶20 起始，然后依次对倍稀释至1∶640，共6个稀释度，每个稀释度的血清均含20pg·ml-1的乐复能。每稀释度做复孔，然后将稀释好的血清样品加入第一天铺有WISHⅠ细胞的细胞培养板中，每孔加入100μl。

2.2.2 标准品 取自制乐复能原液，再用完全培养液将乐复能稀释至15 pg·ml-1；然后依次对倍稀释至0.47 pg·ml-1，共6 个稀释度，每块细胞板中加入一组标准品稀释液，每个稀释度2孔，每孔100μl。

2.2.3 细胞对照 将阴性血清1∶20 稀释，每块细胞板中加入3个孔，每孔 100μl。

以上2.1至2.3操作完毕后，将细胞板置CO2孵箱（5% CO2，37℃）中，培养18～24小时。

2.3 第3天 攻毒

2.3.1 病毒液的配制 从毒种库中取出水泡性口炎病毒（VSV，-70℃保存），加入细胞攻毒液，配成100 CCID50的病毒攻击液备用。

2.3.2 取出细胞培养板，弃去板中液体并拍干，加入制备的病毒液每孔100μl，3个细胞对照孔加入完全培养基，余加入细胞攻毒培养液。

2.3.3 培养 将细胞板置CO2孵箱（5%CO2，37℃）中，培养18～24小时。

2.4 第4天 终止

镜检标准品孔5 0%病变点约在2 pg·ml-1。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液 50μl置30分钟后，用流水小心冲去染色液，待板晾干后每孔加入脱色液100μl，混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，570nm为测定波长，检测吸光度，记录测定结果。

2.5 阳性血清样本中和抗体活性结果

前期研究发现23例受试者出组时(给药后第50天或第43天)，除1#受试者外均产生了抗药抗体，但中和抗体活性结果检出率为0%，结果如附表所示。

3 讨论

干扰素抗体的发生率因干扰素种类的不同有差异，目前认为基因重组α干扰素的抗体出现率明显高于天然α干扰素(人白细胞干扰素或人类淋巴母细胞干扰素) ，临床上应用的IFN-α有IFN-α2a、IFNα2b、IFN-αl三种，一般认为IFN-α2a产生抗体的阳性率及效价最高，IFN-α2b次之，IFN-α1最低，其中，INF-α2a的抗体产生率为20%～40%，INF-α2b的抗体产生率为6.9%～40%，INF-αNl为 0.97%[8][9][10]。干扰素抗体可根据是否中和干扰素的生物学活性分为两种：一种为中和抗体(NA)，可与干扰素的生物学活性位点结合，中和干扰素活性，降低血清干扰素水平，从而使干扰素失去生物学活性；另一种为结合抗体(BA)，当它与干扰素结合时，不影响干扰素的生物学活性。刘劲阳等[11]， 陈宪锐等[12]多篇研究中均报道中和抗体的出现与干扰素治疗失败显著相关，中和抗体是影响干扰素治疗疗效的重要因素之一。本研究中乐复能应用于患者后，抗药抗体产生率接近100%，但却没有中和抗体活性。初步推测乐复能中和抗体的产生率低于普通干扰素，需要后期临床试验加大受试者例数来确证。由于干扰素临床适应症广泛，疗效确切，国内临床需求量大，国外进口药品价格昂贵等诸多因素，干扰素类新药物的研发刻不容缓。

附表 佑安医院受试者（抗体阳性）血清样本结束给药时抗体滴度和中和抗体活性