PI3K/AKT信号转导通路与人舌鳞癌细胞TCA8113顺铂耐药的相关性研究

齐长娥，李德超，朱杨，姚丛姗，Hussein Helal，赵艳宇

佳木斯大学 附属口腔医院口腔种植科，黑龙江 佳木斯 154004

口腔鳞状细胞癌是口腔常见的恶性肿瘤之一，其主要治疗药物顺铂已广泛应用于临床，但只有10%～15%的患者病情有所缓解[1-3]，抗肿瘤药物长期应用的耐药问题是制约其临床疗效的主要原因之一。研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphati⁃dylinositol-3-kinases，PI3K）信号传导通路在肿瘤细胞发生和发展中起着非常重要的调节作用，肿瘤细胞通过启动PI3K/Akt信号转导通路，诱导其增殖、分化，避免细胞发生凋亡[4]，特别是对癌细胞耐药有明显的作用[5-6]。LY294002是PI3K特异性抑制剂，近年研究表明，LY294002可以增强某些化疗药物的疗效，起到化疗增敏的作用[8-10]。在此，我们主要探讨了PI3K特异性抑制剂LY294002逆转顺铂耐药口腔鳞癌细胞TCA8113/CDDP的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

人口腔舌鳞癌细胞系TCA8113（军事医学科学院生物工程研究所馈赠）；PI3K/Akt信号传导通路阻滞剂LY294002（Selleck公司）；顺铂（CDDP，齐鲁制药厂）；DMEM/F12培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma公司）；p-Akt单克隆抗体（Ser473）、Akt单克隆抗体、PI3K多克隆抗体（Santa Cruz公司）；鼠抗人β-actin鼠抗人多克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司）。

1.2 耐药细胞系TCA8113/CDDP的建立

取对数生长期的TCA8113细胞，在含0.3 μg/mL CDDP的DMEM-F12培养基（10%胎牛血清，青霉素、链霉素各200 U/mL）中，于5%CO2饱和湿度、37℃培养箱中培养2 d，更换正常培养液，待细胞正常传代后重复加药1次，在进入下一个浓度（以起始浓度的1倍间歇性加药）前培养1周[11]，诱导耐药产生。

1.3 细胞耐药指数的测定

用0.25%胰酶将耐药细胞消化计数，调整细胞浓度为105/mL，接种于96孔板。加药组的CDDP浓度分别为64、32、16、8、4、2、1和0.5 μg/mL，每个浓度设置6个复孔，培养72 h；每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），培养4 h后加入100 μL/孔DMSO，振荡5 min后在酶联免疫检测仪上测定各孔的D490nm值，重复3次。计算IC50及耐药指数（RI）。

RI=耐药细胞系的IC50/亲代细胞的IC50

细胞存活率=（实验组D490nm值/对照组D490nm值）×100%

1.4 MTT检测药物对细胞的抑制率

取对数生长期的TCA8113和TCA8113/CDDP细胞，调整细胞密度为105/mL，接种于96孔培养板（200 μL/孔），待细胞长到70%～80%后将培养液换成分别含5、10、20、40 μmol/L LY294002的培养基，培养24、48 h（联合抑制组：在LY294002作用4 h后，TCA8113细胞加入0.8 μg/mL CDDP，TCA8113/CDDP细胞加入5.9 μg/mL CDDP，继续作用24 h），每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37℃培养箱内继续作用4 h后终止，每孔加入100 μL DMSO，振荡5 min后在全自动酶标仪上测定各孔的D490nm值，并计算不同浓度的LY294002及其联合顺铂对细胞增殖的抑制作用。

1.5 Western印迹检测p-Akt、Akt、PI3K蛋白的表达

不同浓度LY294002作用2种肿瘤细胞4 h后加入CDDP继续作用24 h，然后用预冷的PBS洗细胞3次，将细胞刮下，加入含5%PMSF和1 μmol/L磷酸酶抑制剂的全细胞裂解液75～100 μL，4℃放置1 h，期间不断吹打，15 000 r/min、4℃离心20 min，收集上清液进行定量分析，进行10%的SDS-PAGE，将电泳条带电转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，将膜加到用5%BSA稀释的Akt抗体（1∶400）、p-Akt抗体（1∶400）、PI3K抗体（1∶600）中，4℃孵育过夜，用TBST漂洗4次，加入1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育60 min，加入ECL发光液，在暗室中压片、曝光，用Image Lab凝胶成像系统拍照分析。

1.6 统计学分析

用统计学软件SPSS 17.0处理实验数据。多组间比较用单因素方差分析，所有结果均用x±s表示。

2 结果

2.1 耐药细胞系的建立

TCA8113细胞经0.3 μg/mL CDDP作用后，细胞间质增大，细胞内空泡增多，增殖速度减慢，悬浮死亡较多，细胞形态发生明显变化，比其亲代细胞颜色暗，细胞内颗粒堆积，2～3个月后可见细胞集落，正常传代后递增药物浓度，1年半左右时间初步建成TCA8113/CDDP细胞系，其耐CDDP的浓度为2.9 μg/mL，RI为7.7。

2.2 细胞抑制率的测定

LY294002（浓度分别为0、5、10、20、40 μmol/L）联合CDDP（浓度分别为0.8、5.9 μg/mL）作用于细胞24 h，对于 TCA8113 细胞，比单用 CDDP（0.8 μg/mL）抑制率分别提高了2%、13%、21%和32%；对于TCA8113/CDDP 细胞，比单用 CDDP（5.9 μg/mL）的抑制率分别提高了1%、10%、15%和24%）（图1、2）。说明LY294002对于CDDP有化疗协同的作用。

2.3 LY294002联合CDDP对p-Akt、Akt及PI3K表达的影响

在不同浓度LY294002作用下，TCA8113/CDDP细胞和TCA8113细胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表达有显著差异（P＜0.05）。2组细胞中，在不同浓度LY294002作用下PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表达与对照组相比均差异显著（均为P＜0.05）。

3 讨论

建立肿瘤耐药细胞株的方法主要有基因转染法[13]和药物筛选法[14]。基因转染法是利用质粒、微脂体或病毒颗粒等作为载体，将特定的耐药基因片端转入肿瘤细胞，使其在新的细胞中表达而形成新的具有化疗耐药性的肿瘤细胞株。药物筛选法是将肿瘤细胞株反复暴露于化疗药物中，并逐渐增加药物的浓度，引起细胞基因谱表达改变，从而使细胞株表现出化疗耐药的特性。我们采用药物筛选法建立耐顺铂的舌磷癌细胞，起始药物浓度为0.3 μg/mL，经过1年半左右的时间初步建立了耐药性为3.2 μg/mL的TCA8113/CDDP细胞，耐药指数为7.7。与以往其他细胞的耐药细胞起始顺铂浓度3.0 μg/mL有所不同，起始药物浓度较低。

顺铂应用于临床多种实体肿瘤如睾丸癌、卵巢癌、食道癌、头颈部癌和小细胞肺癌等的治疗，而非小细胞肺癌和直肠癌在一期治疗后常产生耐药性。临床报道有多种顺铂导致耐药的机制，其中主要包括药物外流增加、药物吸收减少、GST-π被激活解毒功能增强、凋亡受限、DNA损伤修复等[15-16]。研究发现，CDDP可以激活多种信号转导通路，包括ATR、p53及MAPK信号通路，最终通过活化Caspase-3促进细胞抗凋亡[17]。本实验中，当顺铂初期作用于舌鳞癌细胞时，细胞会大量死亡，只有少量存活，但经过1年半时间的培养，细胞会对顺铂产生稳定的耐药性，在顺铂含量为2.86 μg/mL的培养基中可以正常传代。

图1 LY294002对TCA8113和TCA8113/CDDP细胞的抑制率

PI3K/AKT细胞转导通路被认为是肿瘤细胞存活的首要通路，与肿瘤的发生、发展密切相关，在肿瘤细胞恶性增殖、转移，以及对放、化疗的拮抗中起重要作用[18]。p-AKT可将Bad磷酸化，失去与Bcl-XL结合的能力，恢复Bcl-2的抗凋亡能力[19]。LY294002能与PI3K竞争性结合ATP位点，通过抑制Akt的激活，能完全特异性地抑制PI3K的活性。本实验中，随着LY294002浓度的增大，耐药和非耐药口腔鳞癌细胞的抑制率都增加。这2种不同的细胞间，耐药细胞中AKT、p-AKT、PI3K的表达要比正常细胞明显增高，在同时用40 μmol/L的LY294002联合CDDP作用于2种细胞时，耐药细胞的PI3K表达比其亲代多39.6%，Akt蛋白多50%，p-AKT蛋白多17%。耐药细胞在CDDP的长期作用下，PI3K/AKT信号通路的表达比其亲代细胞TCA8113活跃，TCA8113/CDDP细胞中信号传导通路被激活，耐药细胞抗凋亡的能力比其亲代细胞要强。如何抑制PI3K/AKT信号转导通路中蛋白的表达，就成为逆转耐药的一条思路。在同一种细胞内，40 μmol/L的LY294002联合顺铂作用于细胞后，细胞的抑制率比空白对照组都高，说明40 μmol/L的LY294002与顺铂有药物协同作用，同时蛋白的表达也比空白和对照组明显降低。本研究结果表明，抑制PI3K/AKT通路可作为抑制顺铂耐药舌鳞癌细胞的一种方法。

图2 LY294002联合CDDP作用24 h对TCA8113和TCA8113/CDDP细胞的抑制率

图3 TCA8113和TCA8113/CDDP细胞中p-Akt、Akt、PI3K蛋白的表达

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