肺炎链球菌自溶素LytA小片段免疫活性的研究

邹 琴，杨 光，罗 红*，宫晓红，孙文平

(1.大连医科大学临床免疫与微生物教研室，辽宁 大连 116044;2.大连市中医医院，辽宁 大连 116013)

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是社区获得性肺炎的主要病原体，可以发生自然转化［1］，根据其荚膜多糖抗原性的不同分为90多种血清型，其中约20种血清型对人体有致病性，可引起脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎等多种疾病［2-3］。近年来肺炎链球菌耐药的普遍性和多重耐药趋势逐渐升高，开发新的药物和蛋白疫苗进行感染的治疗和预防成为研究热点［4-6］。肺炎链球菌自溶素(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，LytA)是肺炎链球菌细胞壁降解酶之一［7］，其编码基因在不同血清型之间具有高度保守性［8-9］，编码蛋白可以覆盖几乎所有血清型，而且具有免疫活性及溶菌效应，有可能成为新的疫苗靶点及抗菌药物［10-12］。根据GenBank中收录的肺炎链球菌M66菌株的lytA序列设计引物，扩增ATCC49619菌株相应基因片段，以常用的BamHⅠ、HindⅢ酶切后出现新的小片段，通过原核表达技术获得该段基因表达的蛋白，初步研究其免疫活性，为进一步应用于疫苗及相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 肺炎链球菌标准菌株(ATCC49619)由卫生部临床检验中心提供。

1.1.2 主要试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)，限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA 连接酶、DNA Marker、蛋白Marker、DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)，大肠埃希菌DH5α、表达菌株BL21(DE3)感受态、HRP-羊抗鼠IgG(Novagen公司)，克隆载体PGM-T、质粒提取纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)，表达载体PET-32α(本实验室保存)，化学发光底物Super-Signal ECL(Pierce公司)，纯化蛋白LytA'免疫血清为本实验室自制(抗体效价1∶32)。

1.2 方法

1.2.1 肺炎链球菌自溶素基因扩增、克隆 根据GenBank中肺炎链球菌M66菌株lytA基因全序列(FN549899.1)，设计上下游引物:P1为 5'-GGGGGATCCATGGAAATTAATGTGAGT-3'，P2 为5'-GGGAAGCTTTTTTACTGTAATCAAGCCATC-3'，斜体部分为引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，引物由 TaKaRa公司合成。提取肺炎链球菌(ATCC49619)基因组DNA，PCR反应扩增目的片段(95℃ 4 min;95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min、30个循环;72℃ 7 min)，反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。切胶回收，构建克隆质粒PGM-T/lytA'，测序由TaKaRa公司完成。

1.2.2 重组表达质粒的构建与鉴定 测序正确的克隆质粒用BamHⅠ、HindⅢI双酶切，将出现的约500 bp小片段切胶回收，与pET-32α(+)载体酶切后的片段16℃过夜连接，转化至感受态细胞E.coli DH5α，于LB/Amp平板上挑取单个克隆培养后，抽提质粒进行双酶切鉴定并再次测序，构建重组表达质粒pET-32α(+)/lytA'。

1.2.3 重组表达质粒的诱导表达与纯化 将鉴定正确的重组表达质粒转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于LB/Amp平板，筛选阳性克隆接种于LB/Amp液体培养基，37℃培养至对数生长期(A600值为0.6 ～0.8)，加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG，25℃诱导4 h;4℃离心收集菌体，加入裂解液超声破碎，4℃离心收集上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳。用透析袋等电点洗脱法回收纯化蛋白LytA'并定量分析，保存于－80℃冰箱。

1.2.4 免疫血清制备 取6只BALB/c小鼠，雌雄各半，18～20 g，5～6周龄(大连医科大学实验动物中心提供)。LytA'免疫血清制备程序:首次免疫每只小鼠腹股沟皮下注射LytA'0.2 mg;分别于第14及第21天加强免疫，每只皮下注射0.2 mg。末次免疫后第5天摘取小鼠眼球进行采血，分离血清，与纯化蛋白进行双向免疫扩散试验，测定抗体效价后于－20℃冰箱冻存备用。

1.2.5 表达产物 Western blot分析 将纯化的LytA'蛋白按常规方法进行SDS-PAGE电泳后转到NC膜上，以上述免疫血清作为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗，ECL显影。

2 结果与分析

2.1 肺炎链球菌自溶素基因的扩增、克隆

lytA全序列扩增产物约950 bp处可见特异性条带(图1)，与预期结果(956 bp)相符。重组克隆质粒PGM-T/lytA测序结果与GenBank中M66菌株的基因序列符合率为98%，不同之处主要位于444～466 bp，肺炎链球菌ATCC49619菌株新增了一个BamHⅠ酶切位点(GGATCC)，PGM-T/lytA经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后出现3条带(图2)。

图1 肺炎链球菌lytA的PCR扩增电泳图Fig.1 PCR amplification of lytA of S.pn

图2 重组质粒PGM-T/lytA酶切图Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid PGM-T/lytA

2.2 重组表达载体的构建及鉴定

构建的小片段自溶素的重组表达质粒pET-32α(+)/lytA'经 BamHⅠ、HindⅢ双酶切后显示约500 bp目的片段。序列测定结果显示该片段基因与肺炎链球菌ATCC49619菌株的克隆质粒PGMT/lytA相应部分符合率为100%，未出现变异。

2.3 重组表达质粒诱导表达与纯化

小片段自溶素的重组表达质粒 pET-32α(+)/lytA'经IPTG诱导后，在相对分子质量(Mr)约20 ku处有明显的蛋白表达条带(图3)，该蛋白主要以可溶性上清形式存在，用等电点洗脱法纯化后电泳显示为单一蛋白条带(图4)。

2.4 免疫血清制备

LytA'免疫小鼠血清抗体效价为1∶32，所获得的目的蛋白具有较好的免疫原性。

2.5 Western blot分析

LytA'与相应抗体发生特异性结合，相对分子质量约20 ku处出现明显印迹反应带(图5)，该目的蛋白具有较好的抗体结合活性。

图3 重组表达质粒pET-32α(+)/lytA'的IPTG诱导结果Fig.3 Analysis of the products expressed by pET-32α(+)/lytA'with IPTG induction

图4 纯化蛋白LytA'的SDS-PAGE电泳图Fig.4 SDS-PAGE profile of purified protein LytA'

3 讨论

肺炎链球菌自溶素是肺炎链球菌的主要毒力因子之一，在不同血清型的肺炎链球菌中具有高度保守性，这一特性作为疫苗靶点可以预防不同血清型引起的感染，而且作为蛋白质，可以诱导T细胞依赖性免疫应答，产生免疫记忆，克服了多糖疫苗的局限性［13］。通过基因工程技术获取重组蛋白，不但可以大量获得而且便于分子结构的修饰改良，本研究证明了肺炎链球菌自溶素LytA其中的一个小片段可以通过原核表达技术获得，初步证明具有免疫原性和抗体结合活性，为进一步应用于血清学诊断和疫苗靶点研究奠定基础。

GenBank中尚未收录ATCC49619菌株的自溶素序列，本研究参照已公布的肺炎链球菌M66菌株自溶素序列(FN549899.1)设计引物，成功扩增克隆了肺炎链球菌ATCC49619菌株的956 bp自溶素全片段，所构建的克隆质粒测序结果和M66菌株基因序列同源性为98%，证明了lytA基因序列的保守性。碱基变异的区域主要集中在444～466 bp之间，而且在此区域内碱基的变异恰巧形成了一个BamHⅠ酶切位点，这就提示如果利用ATCC49619菌株表达整段的自溶素蛋白，就需要避免用BamHⅠ酶进行克隆质粒的酶切。本研究中利用BamHⅠ酶切位点来构建小片段自溶素重组表达质粒，成功表达出分子量约20 ku的自溶素蛋白片段，相比于全段rLytA(分子量约56 ku)，小分子量蛋白片段用于药物及疫苗靶点可能更具有优势，而且和抗体结合时有利于减少空间位阻，通过免疫小鼠及Western blot实验证明该蛋白具有免疫原性和抗体结合活性，具有应用于疫苗及血清学诊断的可能性。通常以pET32α(+)载体构建的表达质粒，表达出来的是一种融合蛋白，在目的蛋白的N末端融合有分子量约20 ku的硫氧还原蛋白，本实验中的目的蛋白虽然分子量约为20 ku，但所构建的表达质粒经过测序，证实为自溶素的片段，并非是硫氧还原蛋白，具有不必切除硫氧还原蛋白，直接应用于相关研究的优势。

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