啤酒废酵母自溶制备氨基酸的研究

陈雪梅，陈茂深，徐菲菲，钟芳*

（1.江南大学国家功能食品工程技术研究中心，江苏无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

啤酒废酵母自溶制备氨基酸的研究

陈雪梅1，2，陈茂深2，徐菲菲2，钟芳2*

（1.江南大学国家功能食品工程技术研究中心，江苏无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

以啤酒废酵母为原料自溶制备氨基酸，以水解度为参考指标确定了自溶工艺条件。首先，对氯化钠、半胱氨酸、亚硫氨酸和风味蛋白酶这4种促溶剂进行了研究，结果表明：风味蛋白酶（2.2×104U／g）效果最佳；在此基础上对其他工艺条件如促溶剂添加量、初始p H值、温度和时间进行了优化，通过研究表明最佳自溶条件为风味蛋白酶0.3%、初始p H值6.5、温度45℃、自溶时间20 h，在此工艺条件下水解度为44.29%。并对氨基酸组成进行了分析，结果表明氨基酸水解度为45.24%，且组氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸的水解度较高，高达60%以上。

啤酒废酵母；自溶；水解度；氨基酸

啤酒废酵母常被作为工业废料排放，人们逐渐意识到啤酒废酵母的价值，蛋白50%，氨基酸组成接近理想蛋白质［1－3］。获得氨基酸一般通过自溶，自溶是指酵母细胞中退化的酶被激活后溶解菌体，将大分子物质水解成小分子物质［4－6］。由于酵母细胞内源酶活力有限，可借助物理手段、化学手段和生物手段来提高自溶率。Verduyn C等［7］将自溶与高压均质结合使得细胞破碎程度大大加强，得到的抽提物中总氮含量可高达80%以上，但物理手段能耗较大、成本高。Breddam Klaus等［8］通过添加氯化钠使得啤酒废酵母进行质壁分离后再促使自溶，自溶程度增大。在Tsang Shekkwan等［9］的研究中指出加入酶可增大自溶程度。大多数研究指出自溶提高，但并未对自溶得到的氨基酸进行分析。

此外，Illanes A等［10］研究指出经过干燥的酵母可以加速自溶的进行。因此，本文以经过喷雾干燥后的啤酒废酵母为原料，首先研究了不同促溶剂对自溶制备氨基酸的影响，并探究了其最佳工艺条件，最后对所得的自溶液进行氨基酸组成分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料与试剂

啤酒废酵母 宜兴江山生物技术公司；风味蛋白酶（2.2×104U） 诺维信有限公司；氯化钠、半胱氨酸、亚硫酸钠、碳酸氢钠、结晶乙酸钠、醋酸、四氢呋喃、乙腈、甲醇 中国国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

酶反应器 无锡市东升玻璃仪器厂；DL-5-B低速大容量离心机 上海安亭科学仪器有限公司；RT10磁力搅拌器 德国IKA公司；Agilent 1100安捷伦高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；MP-501A超级恒温槽 上海一恒科技有限公司；EL-20 p H计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脱苦

将过筛后的啤酒废酵母加入0.5%（W／W）的NaHCO3溶液，浸泡30 min。再以4000 r／min离心10 min得到啤酒废酵母泥，再以1∶4加入蒸馏水洗涤废酵母泥至洗涤液p H值为6～7，所得啤酒废酵母泥备用。

1.2.2 自溶

啤酒废酵母泥以一定比例的蒸馏水搅拌均匀，加入促溶剂，调节p H值在恒定温度下反应一段时间。取出沸水浴20 min进行灭酶处理，待冷却后离心（4000 r／min，10 min）分离得到自溶液。

1.2.3 水解度（DH）测定［11］

1.2.4 工艺优化

以促溶剂种类、促溶剂用量、初始p H值、温度和自溶时间5个因素对啤酒酵母的自溶程度进行单因素实验，见表1。以水解度为指标确定啤酒废酵母的最佳自溶条件。单因素实验是固定其中4个因素，分析第4个影响因素与自溶程度的关系。

表1 自溶工艺单因素实验水平表Table 1 Single factor experimental levels of autolysis technology

1.2.5 氨基酸分析

根据文献［12］的方法进行分析。

2 结果与分析

由于啤酒废酵母中还残留有较多的酒花和吸附在其表面的一些代谢产物使其具有苦味，Shotipruk Artiwan等通过微滤的方法对啤酒废酵母进行了脱苦处理，不仅使得苦味物质大大减少并且提高了蛋白质产量。而另外一种较为常用的方法，则是在啤酒废酵母中加入酒精、食用小苏打（碳酸氢钠）等进行脱苦处理。对于碳酸氢钠的添加量，一般浓度为0.5%［13］，本文选择0.5%食用小苏打进行脱苦处理。

水解度是指蛋白质分子中通过生物的或化学的方法水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例，是衡量蛋白质水解程度的一个重要指标。因此，本文主要以水解度为指标进行自溶工艺条件优化。

2.1 促溶剂的影响

增加自溶率的化学试剂和酶制剂都叫作促溶剂，本文主要选择了研究较多的4种促溶剂：氯化钠（3%）、半胱氨酸（0.3%）、亚硫酸钠（0.3%）和风味蛋白酶（0.3%），不同促溶剂的添加量根据文献确定［14－16］。工艺条件为：水添加量为酵母泥的3倍，调节p H值至6.0，于45℃自溶24 h，于沸水浴中加热20 min灭酶后，测定其水解度，结果见图1。

图1 促溶剂对自溶程度的影响Fig.1 Effect of promoters on degree of autolysis

由图1可知，在4种促溶剂中，风味蛋白酶的效果最好，其水解度达到35%以上，而其余3种促溶剂对啤酒废酵母的自溶程度影响相比于空白样品并没有明显提升效果。然而添加的风味蛋白酶，是一种复合蛋白酶，当作用于啤酒废酵母时，一方面可以分解细胞壁表面的蛋白质而使酵母细胞壁出现孔洞，使得酵母细胞自身的蛋白酶溶出而继续对啤酒废酵母起作用，酶解蛋白质，溶出氨基酸。另一方面，风味蛋白酶也作为一种外添加的酶制剂作用于啤酒废酵母中的蛋白。综合这两个方面的原因，使得风味蛋白酶作为促溶剂大大增强了自溶程度，故选择风味蛋白酶作为促溶剂。

2.2 促溶剂添加量的影响

自溶工艺条件为：分别加入0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%（W／W）风味蛋白酶（2.2×104U／g），调节p H值至6.0，45℃自溶24 h，沸水浴中加热20 min灭酶，测定其水解度，结果见图2。

图2 促溶剂添加量对自溶程度的影响Fig.2 Effect of promoters＇amount on degree of autolysis

由图2可知，随着风味蛋白酶的含量逐渐增加，水解度逐渐升高，且升高速率由急变缓。当风味蛋白酶添加量达到0.3%时，其水解度高达40%，综合考虑酶的成本及随酶添加量所增加的效果，选择风味蛋白酶添加量为0.3%。

2.3 初始p H值的影响

加入0.3%（W／W）风味蛋白酶（2.2×104U／g），分别调节p H值至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，45℃自溶24 h，沸水浴中加热20 min灭酶，测定其水解度，结果见图3。

由图3可知，体系初始的p H值对自溶程度的影响较明显，当p H值从5.0上升至8.5时，水解度先上升再下降，当p H值处于6.5左右时，其水解度最高，为38.89%。由于整个体系含有多种蛋白酶，而随着自溶作用的进行，其体系的p H值也会发生改变，但实验结果表明在初始p H值为6.5时，这几种蛋白酶对啤酒废酵母自溶的综合作用效果最好。Champagne Claude P等研究了p H值对自溶效果的影响，结果显示p H值在5～7之间，肽酶能较好作用。由此确定自溶的起始p H值为6.5。

2.4 温度对自溶的影响

加入0.3%（W／W）风味蛋白酶（2.2×104U／g），调节p H值至6.5，分别于35，40，45，50，55℃自溶24 h，沸水浴中加热20 min灭酶，测定其水解度，结果见图4。

图4 温度对自溶程度的影响Fig.4 Effect of temperature on degree of autolysis

由图4可知，温度的变化对自溶的影响较大，随着温度的升高，水解度逐渐增大，当温度达到45℃时，水解度最高，为39.53%，而随着温度的继续升高，水解度则逐渐减少。温度对自溶的影响与体系的p H值类似，都是通过影响自身酶活性从而影响自溶效果。结果表明：当温度为45℃时，体系中各种酶能处于一个较好的协同状态，所以自溶的温度选择45℃。

2.5 时间对自溶的影响

加入0.3%（W／W）风味蛋白酶（2.2×104U／g），调节p H值至6.5，于45℃分别自溶4，6，8，10，12，16，20，24，28，32 h，于沸水浴中加热20 min灭酶后，测定其水解度，结果见图5。

图5 时间对自溶程度的影响Fig.5 Effect of time on degree of autolysis

由图5可知，从总体趋势上看，随着自溶时间延长水解度逐渐升高。同时，自溶时间从4 h增加至20 h时，其水解度增加幅度较大；而当自溶时间从20 h延长至32 h时，水解度增幅很小。自溶32 h的水解度为48.57%，而当自溶时间为20 h时，其水解度已经达到44.29%。郭广超等［17］的研究指出在外加酶促的条件下，随着自溶时间的延长，酵母抽提液的产品得率不断增加，在28 h时产品得率趋于稳定。所以综合考虑选择自溶时间为20 h。

2.6 自溶前后游离氨基酸分布情况

甲醛滴定法可知氨基酸总量，但不清楚氨基酸分布情况，故在确定啤酒废酵母的自溶工艺条件后对啤酒废酵母的氨基酸组成进行分析测定，氨基酸组成见表2。

表2 自溶前后氨基酸分布Table 2 Amino acid distribution before and after autolysis

续 表

由表2可知，经过自溶作用，总的游离氨基酸含量为45.24%，与甲醛滴定法所得结果具有较好的一致性。其中，经过自溶后，半胱氨酸和甲硫氨酸几乎都被水解，以游离的形式存在于自溶液中。半胱氨酸和甲硫氨酸都是含硫氨基酸，是产生风味的重要氨基酸。另外，组氨酸、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸的水解比例同样较高，都在60%以上，其中亮氨酸经过美拉德反应可以产生干酪的焦香［18］。从氨基酸的含量上来看，天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸的含量均在1 g／100 g以上，其中丙氨酸通过美拉德反应可以产生焦糖味。由此可知，啤酒废酵母自溶制备的氨基酸可用于制备风味物质，这为风味物质的制备提供了思路。

3 结论

首先本文通过研究4种促溶剂对啤酒废酵母自溶的影响，风味蛋白酶效果最佳。说明对啤酒废酵母的细胞壁破碎而言，生物酶制剂的效果优于通过质壁分离的氯化钠、亚硫酸钠等。其次，本文通过单因素实验确定了啤酒废酵母制备氨基酸的工艺条件：风味蛋白酶（2.2×104U／g）添加量为0.3%（W／W），初始p H为6.5，温度为45℃，自溶时间为20 h，水解度为44.29%。最后，本文对啤酒废酵母自溶后的氨基酸组成进行了分析，发现氨基酸含量丰富，是用于制备风味物质的良好原料。

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Research on Preparing Amino Acids with Waste Beer Yeast

CHEN Xue-mei1，2，CHEN Mao-shen2，XU Fei-fei2，ZHONG Fang2*
（1.National Engineering Research Center for Functional Food，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Use the beer yeast residual as raw material for preparing amino acids and the degree of hydrolysis is as the index to confirm the conditions of autolysis.Firstly，study the influence of four promoters such as sodium chloridethe，cysteine，methionine and flavorzyme，it turns out that flavorzyme（2.2×104U／g）has the best effect.On this basis，study the influence of other conditions such as additive amount of promoters，initial p H，temperature and time，it turns out that the optimization conditions of autolysis are flavorzyme of 0.3%，initial p H value of 6.5，autolysis temperature of 45℃，autolysis time of 20 h.The degree of hydrolysis（DH）reaches up to 44.29%under such conditions.And then analyze the composition of amino acids，the result shows that DH reaches up to 45.24%，and the DH of histidine，threonine，valine，phenylalanine，isoleucine，leucine and lysine is higher，which can reach up to 60%.

waste beer yeast；autolysis；degree of hydrolysis；amino acid

TS201.57

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.007

1000-9973（2017）10-0029-04

2017－06－15 *通讯作者

陈雪梅（1990－），女，四川内江人，助理实验师，硕士，研究方向：功能食品；钟芳（1972－），女，河南新乡人，教授，博士，研究方向：食品科学。