耐热木聚糖酶源细菌筛选、鉴定及酶学性质

谢凤珍,华承伟,牛宏阳

（河南科技学院,河南新乡453003）

木聚糖是自然界中含量仅次于纤维素的第二大类多糖,是半纤维素中含量最丰富的一种,占地球可再生有机碳的三分之一[1].木聚糖主链是由多个β-D-吡喃木糖基通过β-1,4-糖苷键连接的复杂分子多聚糖,它的存在使谷物中的营养物质不能被充分暴露于动物消化液的表面,进而影响动物的消化吸收,降低了饲料的营养价值[2-3].木聚糖酶（xylanase,EC3.2.1.8）主要以内切方式作用于木聚糖主链上的β-1,4-糖苷键,水解生成以木二糖为主的低聚糖[4],它在生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业中有着广泛的应用[5-7].耐热木聚糖酶菌株的筛选是木聚糖酶研究的一个热点,对该酶的开发与研究在解决工业用酶制剂容易热失活、保存稳定性差的缺陷方面具有重要的意义[8].本试验对筛选得到的耐热产木聚糖酶菌株Bacillus megaterium FLH-2的酶学性质进行了初步探究.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 河南新乡周边土壤、太行山南麓丛林土壤及腐殖质.

1.1.2 培养基

筛选及分离培养基/（g/L）：NH4Cl 1.0,（NH4）2SO41.0,K2HPO40.1,CaCl20.4,MgSO4·7H2O 0.1,玉米芯木聚糖1.0,琼脂粉15,NaOH调pH至7.2.

发酵培养基/（g/L）：蛋白胨10,酵母粉10,玉米芯（过60目筛）20,K2HPO41.0,MgSO4·7H2O 0.3,CaCl20.4,FeSO4·7H2O 0.1.

1.1.3 试剂 酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid公司）,榉木木聚糖（Sigma公司）,玉米芯木聚糖（自制）,其他试剂均为分析纯.

1.1.4 主要仪器 BIOLOG自动微生物鉴定系统（美国Biolog有限公司）,722型分光光度计（上海青华科技仪器有限公司）.

1.2 试验方法

1.2.1 产酶菌株分离 分别取土样及腐殖质1 g左右,加入装有10 mL灭菌的质量分数为0.9%的NaCl溶液的小三角瓶中,室温振荡30 min,取0.1 mL涂布筛选平板,倒置,于50℃培养2～3 d.用灭菌牙签挑取单菌落,转接于分离培养基进行单菌落分离.

1.2.2 产酶菌株复筛 用接种针挑取单菌落,接种于发酵培养基,200 r/min,50℃培养2 d.取发酵液1 mL,10 000 r/min离心5 min,取上清,按“1.2.3”的方法测定酶活,取酶活最高的菌株进行菌种鉴定.

1.2.3 酶活测定 取1.0 mL榉木木聚糖溶液与经适当稀释的酶液0.1 mL混合,反应10 min后,沸水煮沸10 min中止反应,以木糖等作标准,酶活力通过DNS测定还原糖法进行[9].酶活力的单位定义为：50℃,pH 6.0的磷酸缓冲液（50 mmol/L）及榉木木聚糖溶液质量浓度为1 g/L的条件下,每min生成1 μmol还原糖所需要的酶量.

1.2.4 菌种初步鉴定 采用美国Biolog公司GenⅢ生化鉴定板进行鉴定：经33℃平板培养基过夜培养的菌种,于超净工作台中用棉签点取纯种的单个菌落至接种液IF3中,制备透光率在90%～95%的菌悬液,用8道移液器,按每孔100 μL的量加到GenⅢ板的所有微孔中,置于33℃的恒温培养箱中培养,每隔4 h观察微孔板中的颜色变化,待其颜色变化较明显时用Biolog自动微生物鉴定系统对结果进行扫描分析,并与Biolog数据库中的数据相比较.

1.2.5 粗酶的制备 在预试验的基础上,发酵液经质量分数分别为40%和60%的硫酸铵分段盐析,沉淀重溶于蒸馏水,经过夜透析后,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清,即为粗酶样品.

1.2.6 最适pH与最适温度测定 分别测定粗酶液在pH 2.5～11.0的4种不同缓冲液（50 mmol/L,柠檬酸缓冲液pH 2.5～5.5,MES缓冲液pH 5.0～7.0,磷酸缓冲液pH 6.0～8.5,甘氨酸-NaOH缓冲液pH 8.5～11.0）中的酶活,以最高酶活作为100%；分别于30～90℃测定酶活,以最高酶活作为100%.结果为3次重复的平均值.

1.2.7 pH和温度稳定性测定 取适量的酶样品分别于1.5 mL离心管中与不同pH值的缓冲液混匀,水浴锅中25℃保温30 min,立即置于4℃水浴中复性20 min；另取适量酶样品于1.5 mL离心管中于不同温度下保温30 min,立即置于4℃水浴中复性20 min.酶样品经适当稀释后按“1.2.3”的方法测定酶活,以最高酶活作为100%.结果为3次重复的平均值.

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的筛选与鉴定

经含单一碳源的木聚糖筛选平板和50℃筛选,共筛选得到产木聚糖酶真菌菌株12株,经摇瓶发酵复筛,发现1株细菌产酶活较高,可达624 U/mL,暂命名为XynB2.该菌株在40～55℃范围内生长良好,最适生长温度50℃左右.菌落圆形,表面粗糙不透明,污白色（见图1）.经Biolog自动微生物鉴定系统对GenⅢ生化鉴定板培养生化结果进行扫描分析,扫描结果与Biolog数据库中的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium相似度达98%,初步命名该菌为B.megaterium FLH-2.

图1 菌株XynB2菌落Fig.1 Colony morphologof XynB2

2.2 酶性质分析

2.2.1 木聚糖酶最适pH和pH稳定性 木聚糖酶最适pH和pH稳定性测定结果见图2.

图2 木聚糖酶最适pH和pH稳定性Fig.2 The optimal and stability pH of xylanase from Bacillus megaterium FLH-2

由图2可知,该芽孢杆菌所产木聚糖酶最适pH约为6.0（图2（a））,在pH 5.0～7.0之间,相对酶活可达最高酶活的80%以上.在pH 5.0～9.0之间,处理30 min,相对酶活仍可保持80%以上（图2（b））,说明该酶具有较宽范围的pH稳定性.

2.2.2 木聚糖酶最适温度和温度稳定性 木聚糖酶最适温度和温度稳定性测定结果见图3.

图3 木聚糖酶最适温度和温度稳定性Fig.3 The optimal and stability thermoof xylanase from Bacillus megaterium FLH-2

由图3可知,该芽孢杆菌所产木聚糖酶最适作用温度约为65℃（图3（a））,高于80℃,酶活显著降低.在30～75℃之间,相对酶活可达最高酶活的80%以上（图3（b））,表明该木聚糖酶有较宽的温度作用范围和良好的耐热性.

3 结论

从新乡周围土样及腐殖质筛选得到1株产耐热木聚糖酶的巨大芽孢杆菌B.megaterium FLH-2,其最适生长温度50℃,在40～55℃之间,生长良好.巨大芽孢杆菌生长温度一般在3～45℃,最适温度为30℃,只有极少数可在63℃生存[10-11],这就为耐热酶的产生提供了条件.

该菌株所产木聚糖酶最适pH和温度分别为6.0和65℃,在pH 5.0～9.0之间、温度低于75℃条件下,相对酶活可达最高酶活的80%以上.目前报道的该菌所产木聚糖酶一般为耐碱性酶[12],而本研究中该菌所产木聚糖酶同时具有良好的耐酸性,表明该木聚糖酶可很好地应用于食品及饲料工业中.

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