索拉菲尼对肝星状细胞活性及活化的影响*

王 林，李 波，耿智敏#，徐之超，陈 晨，李文智，郑见宝

1)西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科 西安 710061 2)西安交通大学医学院第一附属医院普通外科 西安 710061

肝纤维化系指肝组织内细胞外基质(extracellualr matrix，ECM)过度增生与异常沉积，最终导致肝脏结构和功能异常的病理变化，进而发展为肝硬变[1]。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的持续激活是肝纤维化发生发展过程中的关键环节，抑制HSC活化、增殖成为目前阻断、逆转肝纤维化的重要策略。索拉菲尼作为一种多靶点、多激酶抑制剂靶向治疗药物，能明显抑制HCC细胞增殖及血管新生[2]，但其对 HSC有无作用，此方面研究较少。该研究通过体外实验观察索拉菲尼对HSC活性及活化状态的影响，为索拉菲尼治疗肝纤维化提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人HSC细胞系(LX2)购自中南大学湘雅中心实验室;索拉菲尼由拜耳公司馈赠，剂型200 mg/片，用体积分数100%DMSO溶解，－20℃保存。α-SMA兔抗人单抗购自美国Abcam公司，β-actin兔抗人单抗购自北京博奥森公司，ERK1/2兔抗人单抗、p-ERK1/2兔抗人单抗、AKT羊抗人单抗、p-AKT羊抗人单抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗等购自北京中杉金桥生物技术有限公司。TGF-β1和PDGF-BB ELISA检测试剂盒购自美国R＆D公司。

1.2 细胞培养 LX2细胞在37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，培养基为含体积分数10%胎牛血清的DMEM，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 MTT法测定索拉菲尼对LX2细胞的增殖抑制率 取LX2细胞，以5×104孔－1的密度接种于96孔板，培养24 h后加入索拉菲尼，药物浓度分别为0(对照)、1、2、5、10、20、50 μmol/L，每种浓度设 3个复孔。加药后分别培养12、24、36、48 h，然后每孔加MTT(5 g/L)20 μL，继续培养4 h，吸去原培养液，加入 DMSO 150 μL/孔，振荡 10 min，用酶标仪(波长490 nm)测定每孔的A值，增殖抑制率=(对照组A值－实验组A值)/对照组A值×100%。

1.4 免疫细胞化学法检测LX2细胞α-SMA的表达 ①细胞爬片:取LX2细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度为(1～5)×105mL－1。移液器吸取细胞悬液500 μL，分别接种于5组盖玻片上。培养箱孵育4 h，移液器轻轻移去培养液，对照组加1 mL培养液，实验组分别加入1 mL 含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培养液，培养箱内孵育24 h。②免疫细胞化学染色:40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，体积分数3%H2O2封闭10 min，PBS洗3遍，山羊血清封闭(室温下1 h)，甩去山羊血清，加入α-SMA一抗，4℃冰箱过夜。PBS洗3遍，加ABC复合物，室温下30 min～1 h，DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗，自然风干后，中性树胶封固。显微镜下观察α-SMA表达情况，并于400倍镜下选取6个视野进行计分。阳性细胞百分比计分:按照阳性细胞占所有细胞的比例计分，0、＜25%、25% ～、50% ～、75% ～分别为0、1、2、3、4 分。着色强度计分:细胞无着色，0分;浅黄色，1分;棕黄色，2分;棕褐色，3分。2项评分结果相加，0分为阴性(－)，1～分为弱阳性(+)，4～分为中等阳性(⧺)，6～7分为强阳性(⧻)。各组分别设置4个复孔。

1.5 ELISA 法检测 TGF-β1和 PDGF-BB 实验组使用含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培养液，对照组用未加索拉菲尼的单纯培养液。分别干预LX2细胞12、24、36 h后，提取上清，使用 ELISA试剂盒检测上清中TGF-β1和PDGF-BB的水平。各组分别设置5个复孔。

1.6 Western blot检测 AKT/p-AKT 和 ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2取LX2细胞，培养液分别为未添加索拉菲尼和含索拉菲尼1、2、5、10 μmol/L的培养液。培养0.5 h后，倒弃培养液，添加400 μL裂解液，置于冰盒上1 h，离心提取蛋白，蛋白定量后上样20 μL，行Western blot检测各组不同蛋白表达情况。实验内参为β-actin。每组重复3次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0进行数据分析。采用析因设计的方差分析比较各组LX2细胞增殖抑制率、上清 TGF-β1和PDGF-BB水平的差异，各组α-SMA表达情况的比较采用Kruskual-Wallis多组等级资料的秩和检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 索拉菲尼对LX2细胞增殖能力的影响 结果见表1。

2.2 免疫细胞化学染色法检测LX2细胞α-SMA的表达 对照组均有α-SMA表达，1、2、5 μmol/L实验组均有α-SMA表达，但10 μmol/L组几乎无正常形态细胞，α-SMA表达也明显减弱。见图1和表2。

2.3 ELISA 法检测 TGF-β1与 PDGF-BB 结果见表 3、4。

表1 各组LX2细胞的增殖抑制率比较(n=3) %

图1 索拉菲尼作用24 h后LX2细胞α-SMA表达情况(SABC，×100)

表2 各组LX2细胞α-SMA表达情况(n=24)视野

表3 各组上清TGF-β1水平(n=5) μg/L

表4 各组上清PDGF-BB水平(n=5) ng/L

2.4 Western blot检测结果 见图2。可知，各组ERK1、ERK2、AKT 蛋白表达量基本相同，10 μmol/L组 p-AKT、p-ERK1、p-ERK2蛋白表达降低。

图2 各组AKT/p-AKT和ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2蛋白表达情况

3 讨论

索拉菲尼属于分子靶向治疗新药，是一种多靶点、多激酶抑制剂，在抑制肝癌细胞方面已取得重大进展。其作用机制主要为2个方面[2-3]:①通过阻断MAPK通路抑制肿瘤细胞增殖。②通过阻断VEGF受体和PDGF受体，抑制肿瘤血管生成。近年来研究[4-5]发现，索拉菲尼除了可抑制上皮癌细胞的增殖外，还可调节邻近间质细胞的受体酪氨酸激酶信号通路。

活化的HSC是肝纤维化发生时ECM的主要来源[6]。已有研究[7]表明，索拉菲尼用于门静脉高压症可显著改善血流动力学、抑制新生血管形成、减轻肝脏的纤维化，明显降低门静脉压力。索拉菲尼是否可以抑制HSC的活性及活化，继而阻断、逆转肝纤维化，该实验对此进行了研究。

实验发现，索拉菲尼可抑制LX2细胞活性，还发现药物浓度越高索拉菲尼的抑制作用越明显，且随着时间的延长索拉菲尼的抑制作用表现得也越明显。但在48 h时，LX2细胞活性有所恢复，考虑与索拉菲尼药代动力学因素有关。故随后实验作者选用的药物浓度为 1、2、5 和 10 μmol/L，作用时间为12、24 和36 h。

实验中以不同浓度索拉菲尼干预LX2细胞12、24和36 h后，发现其作用机制表现为以下几方面:①索拉菲尼抑制LX2细胞的活化，而α-SMA的表达为HSC活化的标志，活化的HSC是肝纤维化发生和发展的核心环节。免疫细胞化学法检测α-SMA的表达时发现，对照组和实验组中α-SMA的表达有差异，证明索拉菲尼可抑制LX2细胞活化。②索拉菲尼可抑制LX2细胞分泌某些细胞活性因子，包括PDGF-BB和TGF-β1。细胞因子分泌作为HSC活化重要特征之一，主要表现在TGF-β1、PDGF-BB等大量分泌。该实验通过ELISA法检测不同水平索拉菲尼干预下提取的LX2细胞上清中PDGF-BB、TGF-β1的表达量发现，随着药物水平的升高，PDGF-BB和TGF-β1在上清中的水平呈递减趋势，而同一药物水平下，随着时间的延长，PDGF-BB和TGF-β1也呈递减表达，进而达到抑制LX2细胞活化的目的。③索拉菲尼通过抑制LX2细胞的PDGF信号通路，从而抑制其活化。该实验通过Western blot方法检测Ras/ERK通路中ERK1/ERK2和p-ERK1/p-ERK2以及PI3K通路中AKT和p-AKT的变化，可评估索拉菲尼对PDGF信号通路的影响。作者发现对照组和实验组ERK1/ERK2及AKT表达水平基本相同，而其相应的磷酸化状态，实验组表达逐渐减弱，说明索拉菲尼可抑制PDGF信号通路中ERK1/ERK2及AKT的磷酸化，阻断了PDGF细胞通路的正常传导，从而抑制LX2细胞的活化、增殖。

综上，该研究初步证实索拉菲尼可下调HSC上清液中PDGF-BB和TGF-β1的分泌，抑制 PDGF信号通路，最终抑制HSC的活化及活性，为索拉菲尼治疗肝纤维化提供了新的理论依据。

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