睾酮对血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响*

孙丽娜，王 颖#，燕树勋，张彦周，魏子涵，秦 鹏，孙素珂

1)郑州大学第一附属医院老年医学科 郑州 450052 2)河南中医学院第一附属医院内分泌科 郑州 450008 3)郑州大学第一附属医院心内科 郑州 450052 4)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CF)是心肌组织中含量最多的细胞，占60% ～70%，在维持心脏正常结构和功能方面起重要作用[1-2]。在各种致病因素的作用下，心肌间质CF增多，将导致胶原合成增加并过度沉积、基质蛋白合成增多，最终导致心肌纤维化[3]。心肌纤维化是高血压、冠心病、心力衰竭等心血管疾病心肌重构发生发展的重要机制之一[3]。导致心肌纤维化的因素很多，已知肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的过度激活是导致心肌纤维化的重要因素之一。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS中重要的生物学效应分子[4]，可刺激胶原合成，诱导CF增殖，在心肌纤维化、高血压、动脉粥样硬化发生发展过程中发挥重要作用[5]。近年来研究[6-7]显示睾酮对心血管系统有保护作用，但其机制尚不清楚。作者用AngⅡ诱导乳鼠CF，观察睾酮对诱导细胞的细胞周期、胶原合成和ERK1/2蛋白磷酸化的影响，为睾酮应用于冠心病心肌纤维化、心室重构的预防及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 DMEM培养基(Hyclone公司)，新生胎牛血清(杭州四季青公司)，AngⅡ、碘化丙啶(PI)、RNA 酶、睾酮(美国 Sigma公司)，Triton(Amresco公司)，磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗体(美国Cell Signaling公司)，胰蛋白酶(Difco公司)，Ⅱ型胶原酶(Invitrogen公司)，VG染色试剂盒(北京世剂合力公司)，免疫组化试剂盒、鼠抗波形蛋白单克隆抗体及对氨基联苯胺(DAB)底物显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术服务有限公司)，其他试剂为市售分析纯。

电热恒温干燥箱(上海泸南科学仪器厂，202-1型)，流式细胞仪(COULTER Epics-XP-MCL公司)，CO2培养箱(美国热电Scientific公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司，CK2型)，低温高速离心机(德国Heraeus公司，Biofuge28RS型)。

1.2 乳鼠CF的原代提取、传代培养及鉴定 1 d龄Wistar乳鼠20只，雌雄不限，由郑州大学实验动物中心提供，动物编号:0008508。无菌条件下开胸取出心脏，取左心室，将其剪成1 mm3大小的碎块，反复冲洗，加入0.8 g/L胰蛋白酶、0.1 g/LⅡ型胶原酶消化10 min，反复多次，直至组织块消失，收集每次消化液，离心弃上清，加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，置于体积分数5%CO2培养箱中37℃培养。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，差速贴壁2 h，弃上清，待细胞长满瓶壁后用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。实验采用第2～3代的细胞，细胞经鼠抗波形蛋白免疫细胞化学染色鉴定为CF。

1.3 实验分组 实验分4组，分别用无血清DMEM培养液(对照组)、含 10－6mol/L AngⅡ的无血清DMEM培养液(AngⅡ组)、含30 nmol/L睾酮的无血清DMEM培养液(睾酮组)、含30 nmol/L睾酮和10－6mol/L AngⅡ的无血清DMEM培养液(睾酮+AngⅡ组)培养。

1.4 观察指标

1.4.1 细胞周期分布 分组培养24 h后，收集细胞，以体积分数70%的乙醇固定，离心去固定液，加入 500 μL PI综合染液(PI 5 mg，RNA 2 mg，体积分数1%Triton 0.25 mL，生理盐水65 mL，加蒸馏水至100 mL，pH 为7.2 ～7.6)室温染色 30 min 后，上流式仪检测。重复3次。

1.4.2 胶原含量 制备CF爬片，待细胞连接成片后，分组培养24 h，倾去培养基，冲洗，行苏木素染色，冲洗，滴加VG工作液染色，分化、脱水、透明、封片。切片于倒置相差显微镜下观察并摄片，使用Biosins Digital Imaging Systems测定染色区域积分光密度值，以此表示胶原含量。重复3次。

1.4.3 p-ERK1/2的表达 制备 CF爬片，待细胞连接成片后，分组培养30 min，免疫细胞化学染色法测定p-ERK1/2。p-ERK1/2抗体稀释200倍，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。切片于倒置相差显微镜下观察并摄片，采用Biosins Digital Imaging Systems测定染色区域积分光密度值，以此表示p-ERK1/2的表达水平。重复3次。

1.5 统计学处理 用SPSS 17.0进行数据分析，采用2×2析因设计的方差分析比较4组S期细胞比例、胶原含量和p-ERK1/2表达水平，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CF的鉴定 99%以上的细胞波形蛋白阳性表达(图1)，提示CF分离培养成功。

图1 CF的鉴定(SP，×400)

2.2 4组S期细胞比例的比较 见表1。AngⅡ组S期细胞比例较对照组和睾酮组增加，而睾酮+AngⅡ组S期细胞比例较AngⅡ组明显降低。

表1 4组S期细胞比例的比较(n=3) %

2.3 4组胶原含量和p-ERK1/2表达的比较 见图2、3 及表 2、3。

图2 4组胶原的表达(VG染色法，×200)

图3 4组p-ERK1/2的表达(SP，×200)

表2 4组胶原含量的比较(n=3)

表3 4组p-ERK1/2表达水平的比较(n=3)

3 讨论

心肌纤维化主要表现为CF增殖、Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积、细胞外基质蛋白集聚等[8]，是临床多种心脏疾病发生发展的重要病理基础，可致心力衰竭、心律失常、心源性猝死等严重并发症[9]。AngⅡ通过与细胞上受体结合，经细胞内信号转导通路的级联反应，最终促进CF生长及胞外基质蛋白的表达，在心肌重构中发挥重要作用[4]。

睾酮是类固醇激素，是男性体内最重要的雄激素，在维持男性性征、免疫功能等方面起重要作用。自1990年研究发现睾酮对心血管系统有影响后，有关睾酮在心血管疾病影响方面的研究逐渐增多，但目前国内外相关研究结果并不一致。已证实[9-10]血清睾酮水平降低与心血管事件的发生正相关。外源性睾酮与心血管不良事件有关[11]。有研究[12]发现睾酮对心血管系统有保护作用，如抗炎、调节血脂[13]、减轻动脉粥样硬化、扩张血管、保护 AngⅡ诱导的血管重塑等[14]。

丝裂素活化蛋白激酶系统(MAPKs)是多种胞外信号向胞内信号传递的汇聚点和共同通路，是参与AngⅡ生物学效应的重要信号转导通路之一，目前已经确定有 3条 MAPKs亚通路，ERK1/2是MAPKs亚通路之一，而p-ERK1/2为ERK1/2的活性形式[15]。该研究中，作者观察到，10－6mol/L AngⅡ能明显增加CF的S期(DNA合成期)细胞比例及胶原合成，同时能明显增强p-ERK1/2的表达，提示AngⅡ能促进CF的增殖，且该效应可能通过ERK1/2通路实现，这与以往的研究[3-4，16]结果相符。作者还观察到，睾酮+AngⅡ组CF的S期细胞比例及胶原合成较AngⅡ单独作用组明显下降，p-ERK1/2的表达亦显著降低，提示睾酮可抑制AngⅡ诱导的CF增殖及胶原合成，其机制可能与抑制ERK1/2的活化有关。

综上所述，离体情况下睾酮可抑制AngⅡ诱导的CF的增殖及胶原合成，从而在抑制心肌纤维化中发挥重要作用，该抑制作用可能与抑制ERK1/2信号通路有关。

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