聚乙烯亚胺-黄芪多糖共聚物的制备及其基因传递性能观察*

张丹丹，任雪玲，何阿妹，张 红，周宇雪，张振中#

1)河南省人民医院药学部 郑州 450003 2)郑州大学药学院 郑州 450001

人类疾病都直接或间接与基因异常有关，因此基因治疗已成为治疗包括肿瘤在内的多种疾病的有效方法之一[1]。基因治疗成功与否的关键之一在于高效、低毒的基因传递载体[2]。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是最具代表性的高效基因传递载体之一[3]，但其细胞毒性也不容忽视[4]。多糖及其衍生物不仅具有生物相容性好、可生物降解等特点，同时也能够有效压缩DNA并将其转染至细胞内，已逐渐引起人们的关注[5]。但是，多糖通常体内、体外转染效率较低。有研究[6]显示，将PEI接枝在多糖上能够显著提高基因转染效率。Wong等[7]在壳聚糖的结构中接枝PEI，所得产物不仅极大提高了基因转染效率，同时有效降低了细胞毒性。因此，PEI-多糖共聚物已成为目前非病毒基因传递载体的研究热点之一。黄芪是一种重要的中药材，具有抗氧化、抗病毒、提高免疫力等功效[8]。黄芪多糖是黄芪的主要生物活性成分[9]，不仅具有增强细胞免疫力的功效，同时作为一类多羟基醛酮类化合物，可以提供多个反应基团进行改性。该研究中作者对黄芪多糖进行PEI改性，制备PEI-黄芪多糖共聚物(PEI-RAP)，并进一步研究其与核酸的相互作用，探索其负载核酸作为非病毒基因传递载体的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 黄芪多糖(相对分子质量为1.0×104～2.0×104)购自西安斯诺特生物技术有限公司;PEI(相对分子质量为600)购自阿拉丁试剂有限公司;人乳癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞SMMC-7721由郑州大学基础医学院惠赠;绿色荧光蛋白表达载体pEGFP由作者所在的学院构建并保存。十六烷基三甲基溴化铵、羰基二咪唑(CDI)、高碘酸钾(KIO4)、硼氢化钠、氮丙啶、乙二胺均为国产分析纯。

1.2 PEI-RAP的制备及表征鉴定

1.2.1 氮丙啶法[7]将0.1045 g黄芪多糖Ⅰ加入装有10 mL去离子水的50 mL圆底烧瓶中，搅拌下加入0.1526 g KIO4，室温避光反应48 h后将反应溶液装入透析袋中透析48 h。将透析液滴加至含有200 μL乙二胺的5 mL磷酸盐缓冲液(pH 9.8)中，1 h内滴加完毕，室温搅拌36 h。称取0.1011 g硼氢化钠，加入到上述溶液中，搅拌 48 h。再加入0.0504 g硼氢化钠，继续搅拌24 h。将上述反应液加入到2 mL 1 mol/L HCl溶液(含400 μL氮丙啶)中，搅拌5 d。最后将反应液透析3 d，冷冻干燥即得产物Ⅱ。

1.2.2 KIO4-PEI法[10]将 0.1023 g 黄芪多糖加入装有10 mL去离子水的50 mL圆底烧瓶中，搅拌下加入0.1513 g KIO4，避光搅拌48 h后将反应液装入透析袋中透析48 h。将透析液滴加至含有0.2684 g PEI的5 mL磷酸盐缓冲液中，1 h内滴加完毕，然后室温搅拌36 h。将0.1018 g硼氢化钠加入到上述溶液中，搅拌48 h。再次将0.0502 g硼氢化钠加入到上述溶液中，继续搅拌24 h。最后将反应液透析、冷冻干燥即得产物Ⅲ。

1.2.3 CDI-PEI法[11]氮气保护条件下，向含有0.0780 g黄芪多糖的8 mL DMSO中依次加入100 μL三乙胺、0.2120 g CDI的 DMSO 溶液4 mL，避光剧烈反应4 h。然后向反应液中滴加含0.7568 g PEI的DMSO溶液6 mL，最后加入50 μL三乙胺，避光反应24 h。反应液经透析、冷冻干燥，即得产物Ⅳ。

1.2.4 结构表征鉴定 将少量黄芪多糖以及3种反应产物分别与溴化钾压成薄片，在NICOLET iS10型红外光谱仪上测定傅里叶变换红外光谱。

1.3 PEI-RAP与pEGFP的作用

1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测 将PEI-RAP与pEGFP 分别按质量比4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1 混合均匀，室温静置30 min。采用北京君意JY600电泳仪以及美国SIM公司Bio-Best 200E凝胶成像分析系统考察PEI-RAP对pEGFP的负载作用。

1.3.2 粒径与 Zeta电位分析 将 PEI-RAP与pEGFP按质量比12∶1混合均匀，采用英国马尔文公司 Nano-ZS90纳米粒度分析仪测定 PEI-RGP/pEGFP复合物的粒径与Zeta电位。

1.4 PEI-RAP的细胞毒性 将 MCF-7、Hela和SMMC-7721细胞分别接种于96孔板，在体积分数5%CO2、37℃条件下，于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中常规培养，待细胞融合度达到70% ～80%，加入150 mg/L PEI-RAP，24 h后弃去旧细胞培养液，每孔加入0.5 g/L MTT 100 μL，继续培养4 h，小心弃去培养液并加入100 μL DMSO，测定570 nm的OD值。细胞存活率=[(OD实验组－OD空白组)/(OD对照组－OD空白组)]×100%。实验重复3次。

1.5 pEGFP的体外转染 MCF-7、Hela和 SMMC-7721细胞分别在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基和37℃、体积分数5%CO2条件下常规培养。转染前16 h按照每孔1.2×104个细胞接种于96孔板。将 PEI-RAP与 pEGFP按质量比12∶1(18 mg/L PEI-RAP，1.5 mg/L pEGFP)混匀，室温培养30 min后转染细胞。转染48 h后在荧光倒置显微镜下观察。通过细胞计数法对转染效率进行定量。实验重复3次。

2 结果

2.1 PEI-RAP的合成与表征 黄芪多糖以及3种反应的产物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的红外光谱图见图1。通过对比发现，4种样品中均存在3600～3200 cm－1处的多糖O-H伸缩振动峰及3000～2800 cm－1处的C-H伸缩振动峰。但是，只有产物Ⅱ的红外谱图中在1734 cm－1出现了新的特征峰，1734 cm－1是氨基的变形振动峰。实验结果表明，通过氮丙啶法成功制备得到PEI-RAP，而直接将PEI连接在黄芪多糖上的KIO4-PEI和CDI-PEI法并未得到预期产物。

图1 样品的红外吸收光谱

2.2 PEI-RAP与 pEGFP的相互作用 PEI-RAP共聚物与pEGFP以不同质量比结合后的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。由图2可知，随着PEI-RAP共聚物含量的不断增加，pEGFP的量及迁移速率受到影响，当两者的质量比达到10∶1以上时，pEGFP条带完全消失。实验结果表明，PEI-RAP可以负载pEGFP，当两者质量比达到10∶1以上，pEGFP可与PEI-RAP完全结合。

图2 PEI-RAP负载pEGFP的凝胶阻滞实验

当PEI-RAP与pEGFP的质量比为12∶1时，PEI-RAP/pEGFP复合物的粒径为156.61 nm，电位达 +26.89 mV。

2.3 PEI-RAP的细胞毒性 MTT结果显示，当细胞培养液中加入150 mg/L PEI-RAP复合物，MCF-7、Hela和 SMMC-7721细胞的存活率分别为(102.21 ±8.92)%、(96.07 ±7.10)%和(109.52 ±2.05)%。

2.4 pEGFP的体外转染 见图3。转染pEGFP的MCF-7、Hela和SMMC-7721细胞中均能观察到绿色荧光。PEI-RAP复合物将 pEGFP转染至MCF-7、Hela以及SMMC-7721细胞的转染效率分别是(82.64 ±1.27)%、(85.37 ± 6.10)% 和(93.06 ±0.72)%。

图3 PEI-RAP负载pEGFP转染MCF-7(A)、Hela(B)和SMMC-77213(C)细胞株(×200)

3 讨论

在基因治疗领域，寻找理想的基因传递载体仍然是一个挑战。多糖是自然界中广泛存在的一种生物大分子，具有很好的生物相容性[12-13]。但是，在多糖结构中缺乏与核酸相互作用的基团，因此转染效率一直限制其进一步发展。PEI是目前研究最为广泛的阳离子化非病毒基因传递载体。在PEI的表面含有大量氨基，从而携带大量正电荷。这些正电荷的存在不仅使得PEI可以与负电荷的DNA形成稳定的纳米复合物，而且能够通过细胞膜的内吞作用进入细胞内，同时在细胞内通过质子海绵效应释放DNA，从而达到高效传递治疗基因的目的。但是，也正是由于这些高密度正电荷的存在，使PEI表现出一定的细胞毒性[14]。有研究[15-16]显示，将多糖与PEI连接在一起，可以得到一种新型的多糖-PEI复合载体，它不仅具有高基因转染效率，同时不表现出明显的细胞毒性。新型的多糖-PEI复合载体已成为非病毒基因传递载体的研究热点之一。

该研究所选用的黄芪多糖不含有阳离子基团，因此其本身并不适合作为基因传递载体。作者采用化学方法以PEI对黄芪多糖进行阳离子改性，希望能够得到一种新的非病毒基因传递载体。PEI-多糖的制备通常有两种策略，一种是以氮丙啶为单体，直接在多糖分子上聚合得到;另外一种是采用一定反应将多糖分子直接与PEI连接在一起。该研究中，作者尝试用氮丙啶法、KIO4-PEI法和CDI-PEI法制备PEI-RAP。红外吸收光谱显示通过氮丙啶法构建得到了PEI-RAP复合物，而另外两种方法并未得到目的产物，这可能与黄芪多糖的结构有关。文献[17]显示，黄芪多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、木糖等单糖组成，在其分子结构中含有1条主链和多种形式的支链，其复杂的分支结构可能限制相对分子质量较大的PEI的直接连接，造成KIO4-PEI和CDI-PEI法均未得到预期产物。

PEI-RAP与DNA相互作用实验显示，PEI-RAP可以有效负载DNA。另外，PEI-RAP几乎不显示细胞毒性，并且能够将pEGFP转染至3种细胞，成功表达出绿色荧光，具有较高的转染效率。因此，以黄芪多糖为骨架的新型阳离子聚合物PEI-RAP是一种有效的、有潜在应用前景的非病毒基因传递载体。

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