白藜芦醇对膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡及组织蛋白酶B表达的影响*

马曜辉，单中杰

1)新乡医学院 新乡 453000 2)郑州人民医院泌尿外科 郑州 450012

组织蛋白酶B(cathepsin B，CB)属于木瓜蛋白家族，是溶酶体内最重要的组织蛋白酶，能够降解各种组织蛋白[1]。CB除了参与重要的生理功能外还参与了多种肿瘤的生长、侵袭、凋亡过程[2-4]。白藜芦醇(resveratrol，RES)是一种非黄酮类多酚化合物，在葡萄、花生、虎杖等药用植物中广泛存在。RES除了具有抗炎、抗氧化及神经保护等作用外[5]，近年来其抗肿瘤作用备受关注，可以促进多种肿瘤的凋亡。膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，90%以上为移行细胞癌。作者应用RES作用于人膀胱移行细胞癌T24细胞，观察细胞凋亡和CB表达的变化，探讨RES诱导T24细胞凋亡的机制，以期为膀胱癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂和仪器 人膀胱移行细胞癌T24细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;RES(纯度为99%)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，RES用DMSO配置成100 mmol/L的原液，－20℃保存备用。RPMI 1640培养基(武汉博士德生物工程有限公司);逆转录反应试剂盒(日本 Toyobo公司);CB和β-actin一抗(美国Abgent公司);Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司);RT-PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司);PCR仪(德国Eppendorf公司);流式细胞仪(德国Partec公司)。

1.2 T24细胞培养 人膀胱移行细胞癌T24细胞用含体积分数10%胎牛血清、1×105U/L青、链霉素的RPMI 1640培养基在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养。隔天换液1次。2.5 g/L的胰蛋白酶消化、传代细胞。

1.3 T24细胞凋亡的检测 应用流式细胞术。收集对数生长期的T24细胞，将细胞消化并吹散制成细胞悬液，将细胞悬液加入6孔细胞培养板中。待细胞贴壁后，用含终浓度为25 μmol/L RES的培养基继续培养24、48、72 h，以只含有培养基的细胞作为空白对照组，每组3个复孔。严格按照凋亡检测试剂盒说明书操作。细胞分别用2.5 g/L的胰蛋白酶消化、离心，弃上清，重悬，加入 Annexin V-FITC避光孵育15 min，加入PI避光孵育5 min，30 min内流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 CB mRNA表达的检测 采用RT-PCR法。分组同1.3，细胞培养 24、48、72 h 后用 Trizol法提取总RNA溶解于无RNA酶的水中。用酶标仪测定、计算各组提取总RNA的浓度及纯度。按照逆转录反应试剂盒的说明书逆转录cDNA。采用由上海捷瑞生物工程有限公司合成的CB、β-actin引物，序列见表1。RT-PCR反应体系为20 μL，扩增条件为:94℃预变性5 min;94℃45 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃终延伸10 min。配置20 g/L的琼脂糖凝胶，取RT-PCR产物5 μL在80 V的恒压下电泳30 min。用Alpha多功能成像系统采集图像并分析图像，以CB与β-actin电泳条带积分光密度的比值表示CB mRNA的相对表达量。

1.5 CB蛋白表达的检测 采用Western blot法。分组同1.3。用蛋白提取试剂盒提取实验组及空白对照组24、48、72 h的T24细胞总蛋白。提取的蛋白采用BCA法进行蛋白浓度测定。测定后用裂解液将各样本总蛋白的浓度进行配平，使各样本总蛋白浓度相同。沸水3 min，蛋白变性;100 V 60 min，电泳;转膜;封闭;洗膜;一抗孵育(CB按照1∶500稀释，内参β-actin按照1∶1000稀释)，4℃过夜;二抗孵育1 h;洗膜;高灵敏化学发光显色，用Alpha多功能成像系统采集图像并分析图像，以CB与βactin光密度值的比值表示CB蛋白的相对表达量。

表1 引物序列

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析，各组细胞凋亡率和CB表达的比较采用重复测量数据的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组T24细胞的凋亡情况 见表1。

2.2 各组T24细胞CB mRNA的表达 见图1、表1。

图1 各组细胞CB mRNA表达情况

2.3 各组T24细胞CB蛋白的表达 见图2、表1。

图2 各组细胞CB蛋白表达情况

表1 各组细胞凋亡、CB mRNA和蛋白表达情况(n=3)

3 讨论

细胞凋亡是个极其复杂的过程，就目前的研究现状，细胞凋亡途径大致可分为外源性途径(死亡受体凋亡途径)和内源性途径;内源性途径又可以分为经典的线粒体凋亡途径、内质网应激凋亡途径[6]以及2006 年 Terman 等[7]提出的溶酶体线粒体轴凋亡途径。溶酶体线粒体轴凋亡途径指各种原因导致溶酶体膜不稳定，进而使溶酶体内的水解酶释放，特别是半胱氨酸蛋白酶的释放活化。溶酶体中最重要的是组织蛋白酶家族，CB又是其中最重要的一个。这些蛋白酶可以水解促凋亡蛋白，从而直接或间接地导致线粒体膜的通透性增加，使线粒体释放大量的细胞色素C，细胞色素C与细胞质中的凋亡激酶活因子-1结合，启动凋亡小体的形成[8]。凋亡小体活化Caspase家族中的Caspase-9结合，进而活化Caspase-3后裂解细胞底物，导致细胞凋亡[9]。在整个溶酶体线粒体轴凋亡途径中溶酶体内的水解酶起着至关重要的作用。也有研究[10]表明，CB除了参与溶酶体线粒体轴凋亡途径外，它还可以直接激活Caspase-9，启动细胞凋亡。

RES是一种非黄酮类多酚化合物，最早从毛叶藜芦中获得[11]，随后在多种中药植物的根部均有发现，它主要是植物为对抗外界不良刺激分泌的保护剂。其具有抗氧化、抗炎、抗辐射、保护心血管等作用[5]，近年来其抗肿瘤作用备受关注，目前在肺癌[12]、肝癌[13]、胃癌[14]、前列腺癌[15]、肾细胞癌[16]等组织中均发现其可以促进肿瘤细胞的凋亡。但其作用机制目前被大家认可的一个是通过外源性凋亡途径，外界刺激作用于特异性死亡受体，激活Caspase家族中的Caspase-8，继而活化Caspase-3后裂解多种细胞底物，导致细胞凋亡;一个是经典的线粒体途径，各种原因导致的线粒体通透性增加后，释放细胞色素C，启动形成凋亡小体[17-18]。

该研究观察了RES对人膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡的影响及CB mRNA和蛋白表达的变化，发现RES诱导的T24细胞的凋亡率随时间的延长而升高;随着细胞凋亡率的增加，CB mRNA和蛋白的表达均升高;提示CB可能参与了RES诱导的T24细胞的凋亡，其机制可能为RES作用于细胞后导致细胞溶酶体膜通透性改变，从而导致CB大量释放于细胞质中。以上结果提示可以通过应用CB激活剂来进一步加速膀胱移行细胞癌细胞的凋亡。由于其整体的作用机制还不十分清楚，还需要进一步的研究，以期为临床治疗提供新的理论基础。

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