雷公藤内酯醇联合吉西他滨对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响＊

孙运良，吴红玉，金 晶，满晓华，李淑德△

（1.江苏省赣榆县人民医院消化内科 222100；2.第二军医大学附属长海医院消化内科，上海200433）

胰腺癌是消化系统恶性程度极高的肿瘤，吉西他滨（gemcitabine，GEM）作为目前用于治疗中晚期胰腺癌的一线化疗药物，对于提高胰腺癌患者生存期方面，效果并不令人满意，接受其单药治疗患者的中位生存期仅为6个月左右，1年生存率小于20%［1］。寻求安全有效的方法增强胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性，以期增加GEM的疗效，受到了学者极大的关注。近年来研究发现，雷公藤内酯醇（triptolide，TPL）是一种广谱的抗肿瘤药物，联合其他化疗药物能够发挥协同抗肿瘤的作用［2－6］，但目前关于TPL联合GEM是否具有协同抗胰腺癌作用尚少有文献报道。本研究以TPL、GEM联合作用于体外培养的胰腺癌细胞，观察两药对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响，并检测信号转导与转录活化因子3（signal transducer and activa－tor of transcription 3，STAT3）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶－3（caspase－3）蛋白表达的变化，分析两药联合作用的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞株PANC－1购自美国ATCC公司，于长海医院消化内科实验室保存。TPL购自上海融禾医药科技发展有限公司（纯度大于或等于98.0%），用二甲亚砜（DMSO）配成1mg／mL的原液，磷酸缓冲液（PBS）稀释后备用。GEM为美国礼来公司产品，PBS稀释后备用。Annexin VFITC凋亡检测试剂盒为晶美生物工程有限公司产品。兔抗人磷酸化STAT3（p－STAT3）单克隆抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品，兔抗人caspase－3多克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 PANC－1细胞在含有10%FBS的DMEM培养液中，37℃、5%CO2条件下培养，培养液中含青霉素、链霉素各100U／mL。

1.2.2 细胞毒实验四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测PANC－1细胞增殖 收集对数生长期的PANC－1细胞，调整细胞悬液浓度，将5×103／孔的细胞加入96孔板。待细胞贴壁后，更换为无血清的DMEM培养液进行后续的分组实验，（1）TPL单药组：分别加入终浓度为10、20、40、80ng／mL的 TPL；（2）GEM 单药组：分别加入终浓度为0.01、0.10、1.00、10.00μg／mL的 GEM；（3）联合用药组：10、20、40、80ng／mL的 TPL分别联合1μg／mL的GEM；（4）GEM 单药联合TPL用药组：0.01、0.10、1.00、10.00μg／mL的 GEM 分别联合40ng／mL的TPL；同时以PBS作为对照组。将各组细胞在37℃、5%CO2条件下培养48h后，每孔加入20μL MTT溶液（5mg／mL）。继续培养4h后吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，置于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪波长570nm处测量各孔的吸光度（A）。细胞抑制率（%）＝［1－（实验孔A值／空白对照孔A值）］×100%。两药联合后的交互作用采用金正均法计算q值进行判断［7］；q＝E（a＋b）／（Ea＋Eb－Ea×Eb），其中E（a＋b）为a、b两药合用时对细胞的抑制率，Ea与Eb分别为a、b两药单独应用时对细胞的抑制率。当q值为0.85～1.15时，表明两药具有单纯相加作用；当q＞1.15，表明两药具有协同作用；当q＜0.85，表明两药相互拮抗。

1.2.3 Hoechst33258染色观察细胞凋亡 将处于对数生长期细胞PANC－1细胞分别以5×105／孔接种于6孔板，待细胞贴壁后，分别加入40ng／mL的TPL、1μg／mL的GEM单药或TPL联合GEM，同时以PBS作为对照。将各组细胞继续培养24h后，弃去培养液，PBS洗涤细胞3次，用4%多聚甲醛溶液固定10min，PBS冲洗细胞3次，加入Hoechst33258室温避光染色10min后于荧光显微镜下观察细胞凋亡形态变化。

1.2.4 流式细胞仪检测PANC－1细胞凋亡 将处于对数生长期细胞PANC－1细胞分别以每孔1×105接种于24孔板，待细胞贴壁后，分别加入40ng／mL的TPL、1μg／mL的GEM单药或TPL联合GEM，同时以PBS作为对照。继续培养24h后收集各组细胞，通过流式细胞仪检测细胞的凋亡。具体步骤按Annexin V－FITC试剂盒的说明书进行。

1.2.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测PANC－1细胞p－STAT3、caspase－3蛋白表达 将PANC－1细胞经40ng／mL的TPL、1μg／mL的GEM单药或TPL联合GEM处理24h后，收集细胞，提取细胞总蛋白，蛋白分析系统（Bio－Rad）测定蛋白浓度，20%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），电转移到硝酸纤维膜。室温下用含5%脱脂奶粉的1×TBS封膜2h。分别加入p－STAT3、caspase－3抗体，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育2h，ECL显影。结果用凝胶图像软件分析系统对胶片扫描，与内参照βactin进行比较。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行分析，计量资料以s表示，采用t检验与方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TPL、GEM单药以及联合用药对PANC－1细胞增殖的影响 经不同浓度的TPL单药作用48h后，PANC－1细胞的增殖受到明显抑制，其细胞抑制率随着TPL浓度的增加而增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；且联合用药组的细胞抑制率显著高于TPL单药组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A。金氏公式计算结果显示，10、20、40、80ng／mL的 TPL联合1 μg／mL的 GEM 的q值分别为1.17、1.18、1.16、1.17。随着浓度的增加，无论是GEM单药还是GEM联合TPL均可明显抑制PANC－1细胞的增殖，差异有统计学意义（P＜0.05）；与GEM单药组相比，联合用药组的细胞抑制率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1B；金氏公式计算的结果显示，40 ng／mL的 TPL联合0.01、0.10、1.00、10.00μg／mL的 GEM的q值分别为1.16、1.16、1.18、1.17。

图1 TPL、GEM单药以及联合用药对PANC－1细胞增殖的影响

2.2 TPL、GEM单药以及联合用药对PANC－1细胞凋亡形态的影响 Hoechst33258染色结果显示，TPL、GEM单药组及联合用药组的细胞均出现了典型的细胞凋亡形态学改变，荧光显微镜下可见细胞核浓聚深染、核碎裂和凋亡小体形成等典型的细胞凋亡形态学表现，且联合用药组的凋亡细胞数较TPL、GEM单药组明显增加；而对照组细胞形态正常，细胞核呈均匀弥散荧光，未见明显凋亡染色细胞，见图2。

图2 TPL、GEM单药以及联合用药对PANC－1细胞凋亡形态的影响（×200）

图3 TPL、GEM单药以及联合用药对PANC－1细胞凋亡率的影响

2.3 TPL、GEM单药组以及联合用药组对PANC－1细胞凋亡率的影响 TPL、GEM单药以及两药联合作用24h后，经流式细胞仪检测细胞凋亡的结果显示（图3），对照组的细胞凋亡率为2.6%±0.5%，而TPL、GEM单药组以及联合用药组的细胞凋亡率分别为10.5%±1.0%、14.7%±1.2%和21.1%±2.6%；与对照组相比，TPL、GEM单药组以及联合用药组的细胞凋亡率均明显增加（P＜0.05），且联合用药组的细胞凋亡率显著高于TPL、GEM单药组（P＜0.05）。

2.4 TPL、GEM单药以及联合用药对 PANC－1细胞p－STAT3、caspase－3蛋白表达的影响 Western blot结果显示，TPL单药组以及联合用药组的p－STAT3蛋白表达均较对照组下降，且联合用药组下降更为明显，而GEM单药组的p－STAT3蛋白表达无明显变化；与对照组相比，TPL、GEM单药组以及联合用药组的caspase－3蛋白表达均明显增加，且联合用药组较TPL、GEM单药组更能促进caspase－3蛋白表达，见图4。

图4 TPL、GEM单药以及联合用药对PANC－1细胞p－STAT3、caspase－3表达的影响

3 讨 论

TPL是我国临床上应用的各种雷公藤制剂的主要活性成分，近年来的研究发现，除了具有显著的抗炎、免疫抑制等多种药理作用外，TPL还是一种多靶点的抗肿瘤天然药物；不仅其单药具有强大的抑瘤作用，联合其他化疗药物还可以提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，使肿瘤细胞不容易产生耐药性［2－6］。Pigneux等［4］研究发现，TPL联合低剂量的阿糖胞苷或伊达比星即可明显促进急性白血病细胞的凋亡。Yang等［5］研究显示，TPL与羟喜树碱联合具有较强的协同性，可明显增强羟喜树碱对胰腺癌细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用。本研究结果显示，不仅TPL单药具有体外抗胰腺癌的作用，且联合GEM后可协同抑制PANC－1细胞增殖、诱导细胞凋亡。Zhu等［6］研究也发现，TPL可显著抑制对GEM具有抵抗作用的PANC－1细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡，联合顺铂可发挥协同抗胰腺癌的作用。

尽管已有大量研究证实，TPL联合其他化疗药物能够发挥协同抗肿瘤作用，但其相关机制尚有待于进一步明确。STAT3是STAT家族中的重要成员，在多种细胞因子和生长因子的作用下，其单体中的酪氨酸基团可发生磷酸化形成同源或异源二聚体，进入细胞核与特定的DNA序列结合后启动靶基因转录，参与细胞生长、分化及发育等多种生理过程。近年来的研究已证实，STAT3在胰腺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中呈异常激活，过度激活的STAT3具有促进肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡等作用［8－10］。采用小分子化学药物或siRNA等分子生物学手段阻断STAT3的表达，已成为目前肿瘤分子靶向治疗的新思路。本研究结果显示，TPL在抑制PANC－1细胞增殖、促进细胞凋亡的同时，p－STAT3表达下降，提示抑制STAT3活性是TPL抗胰腺癌的机制之一。目前已有多项研究表明，抑制STAT3通路不仅具有抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡的作用，还可增加GEM以及其他化疗药物的抗肿瘤作用［11－13］。本研究发现，TPL 具有抑制 p－STAT3表达的作用，且联合GEM后，p－STAT3表达进一步下降，表明抑制STAT3通路可能是两药发挥协同抗胰腺癌作用的机制。

caspase是一类半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，通常以无活性的酶原形式存在于细胞质中，经过系列反应被激活后，可参与切割细胞内多种底物，从而导致细胞凋亡，在细胞凋亡过程中起关键作用。caspase－3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。研究显示，caspase－3是STAT3促肿瘤作用的重要下游分子；抑制STAT3通路可上调caspase－3表达，促进肿瘤细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的［14－15］。本研究结果发现，不仅TPL、GEM单药具有促进caspase－3表达的作用，且两药联合后，caspase－3表达进一步增加；提示TPL联合GEM可通过抑制STAT3通路，促进caspase－3表达，从而发挥协同抑制胰腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。

综上所述，TPL不仅其单药具有抗胰腺癌作用，且联合GEM后可协同抑制胰腺癌PANC－1细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡，其机制与抑制STAT3通路，促进caspase－3表达有关。目前在临床上应用的雷公藤制品一般为雷公藤提取物的混合成分，人们对TPL单体的提取分离以及对其在药理作用机制的深入研究，必将对未来在临床上应用TPL联合GEM治疗胰腺癌起到极大的推动作用。

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