瘦素诱导人肝星状细胞活化及其作用机制

李东，黄光龙，曾成林，王亚瑞

（广东省化州市人民医院，广东 化州 525100 E－mail：254599846＠qq.com）

瘦素（leptin）是白色脂肪组织分泌的调节能量代谢的重要激素，通过中枢和外周作用调节机体脂肪和体重。此外，也可以作用于机体广泛分布的瘦素受体，参与调节机体免疫、造血功能、器官纤维化、骨骼代谢、肿瘤和心血管疾病等病理和生理过程［1］。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化为肝纤维化的中心环节，肥胖和糖尿病患者常合并高瘦素血症，而且在肝纤维化动物模型肝脏局部组织瘦素表达也很高，已有一些研究发现瘦素可能直接作用于HSC而促进其激活［2］，但是其中的分子机制尚未明确。因此，本研究通过体外瘦素处理人肝星状细胞（模拟机体高瘦素血症），观察研究瘦素对人肝星状细胞的活化及其作用机制，为临床防治肝纤维化提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 瘦素购自 Prospec公司（Israel），抗 TGF－β1、SREBP－1c、Ⅰ型胶原、α－SMA抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，DMEM培养基以及特级胎牛血清（FBS）购自Gibco BRL（USA）。

1.2 细胞培养 HSC细胞由中山大学实验动物中心提供。在37℃、5%CO2的条件下，培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。

1.3 Western blot测定蛋白的表达 HSCs细胞接种于6cm培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，用预冷的PBS洗两次，加入细胞裂解液，4℃静置30min，12 000r／min离心10 min，取上清，BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDSPAGE分离后，转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5h，随后加入抗TGF－β1、SREBP－1c、Ⅰ型胶原和α－SMA抗体 （1∶1 000），4℃过夜，用TBST洗3次，10分／次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，暗室曝光到X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。

2 结果

2.1 瘦素可以诱导HSCs细胞a－SMA和Ⅰ型胶原表达上调 为了探讨高瘦素血症对HSCs细胞的影响，体外用重组瘦素处理HSCs细胞48h后，与正常对照组比较，α－SMA和Ⅰ型胶原表达显著升高。α－SMA是肌成纤维细胞重要的分子标志，该结果提示瘦素可以诱导HSC细胞活化。而Ⅰ型胶原是细胞外基质（ECM）的主要组成成分，活化的HSCs细胞是Ⅰ型胶原的主要来源细胞（见图1）。所有实验重复3次以上。

2.2 瘦素上调HSCs细胞TGF－β1的表达 TGF－β1在肝脏纤维化中起着关键性作用，活化的HSCs细胞可以分泌TGF－β1。为了观察高瘦素血症可否影响HSCs细胞TGF－β1的分泌，本研究结果显示，HSCs细胞在瘦素（100ng／ml）处理48 h后，TGF－β1的表达显著上调（见图1）。

2.3 瘦素抑制HSCs细胞SREBP－1c的表达 未活化HSC类同于脂肪细胞，而HSCs的激活如同前脂肪细胞的逆分化。固醇调节元件结合蛋白－1c（sterol regulatory element binding protein－1c，SREBP－1c）是调节脂肪细胞分化的关键转录因子［3］。为了探讨瘦素对HSCs细胞SREBP－1c蛋白表达的作用，体外培养的HSCs细胞用不同剂量瘦素孵育48h（见图2），Western Blot检测SREBP－1c蛋白的表达，结果显示，瘦素可以剂量依赖地抑制HSCs细胞SREBP－1c的蛋白表达。

3 讨论

肝纤维化是慢性肝病和各种肝损伤修复创伤的结果，其实质是细胞外基质合成和降解失去平衡的病理过程，也是各种肝病和肝损伤导致肝硬化的最后共同通路［4］。肥胖、糖尿病患者的肝纤维化发生率比正常人高几倍，而其血清瘦素水平很高，提示高瘦素血症与肝纤维化有密切关系［5］。目前已经证实，HSCs活化和增殖是肝纤维化发生的中心环节，HSCs受各种细胞因子的激活而转化是肝纤维化发生和发展的关键［6］。瘦素是由白色脂肪组织分泌的一种肽类激素和细胞因子，通过瘦素受体（Leptin receptor）作用于中枢下丘脑和外周器官组织，影响机体能量代谢和与调节多个系统的功能。近年来有研究提示瘦素可能是一种重要的促肝纤维化因子［7］。

图1 瘦素诱导HSCs细胞a－SMA、Ⅰ型胶原和TGF－β1表达的上调

100 ng／ml瘦素处理HSCs细胞48h后，western blot检测α－SMA、Collagen I、TGF－β1的蛋白表达水平，结果以（±s）表示，n＝5，与对照组比较，＊＊P ＜0.01100 ng／ml瘦素处理HSCs细胞48h后，Western blot检测SREBP－1c的蛋白表达水平，结果以（±s）表示，n＝5，与对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P ＜0.01

图2 高糖抑制HSC细胞SREBP－1c的表达

瘦素在肝脏纤维化的发展中有重要作用，瘦素可能主要作用是激活HSCs细胞促进HSC增殖，而参与肝纤维化的发展。正常生理情况下，肝脏不表达瘦素，但有其受体的表达；而在肝纤维化时，瘦素随肝纤维化程度的增加而不断升高［8］。瘦素激活HSCs细胞而促肝纤维化的作用主要是通过自分泌和旁分泌实现，然而，其中具体的分子机制尚不完全清楚。本研究结果显示：瘦素处理HSCs后可以上调α－SMA、Ⅰ型胶原和TGF－β1表达，提示瘦素可以激活HSCs而参与肝纤维化；此外，TGF－β1是肝纤维化的重要调节细胞因子，参与HSCs表型转变为分泌胶原的肌纤维母细胞，瘦素可以刺激HSCs分泌TGF－β1增多，进一步加重肝纤维化；该结果提示，瘦素激活HSCs参与肝纤维化可能是通过TGF－β1信号通路。没有被激活的HSCs细胞类同于脂肪细胞，HSCs的激活类似于前脂肪细胞的逆分化，SREBP－1c为抑制HSCs活化的关键的转录因子。本研究结果发现，瘦素可以抑制HSCs细胞SREBP－1c的表达。此研究结果提示，瘦素激活HSCs细胞可能与抑制HSCs细胞SREBP－1c表达有关。

综上所述，瘦素可以激活人肝星状细胞，进而参与肝纤维化的发生发展，其分子机制可能与通过激活TGF－β1通路和抑制SREBP－1c通路有关。进一步深入研究瘦素和肝纤维化相互作用的详细机制，对于防治肥胖、糖尿病相关的肝纤维化有重要意义，为肝纤维化机制提供新的实验依据。

［1］ 刘芹，李云，甘立霞，等.瘦素在肝脏中的生理功能及其在肝脏疾病中的作用［J］.现代医药卫生，2012，28（6）：876－879.

［2］ 黄成，马陶陶，李浩，等.豹皮樟总黄酮调控瘦素、TGF－β1对肝纤维化大鼠的预防作用研究［J］.中国药理学通报，2012，28（12）：1666－1671.

［3］ 娄莹莹，李佃贵，周文平，等.肝复健方对瘦素调控肝纤维化大鼠JAK2／STAT3信号通路的影响［J］.中医杂志，2013，54（9）：781－784.

［4］ 张希顺，吕宇航，王玉红，等.丹红软肝胶囊对肝纤维化患者TGF－β1和瘦素的调节作用［J］.西南国防医药，2013，23（4）：358－359.

［5］ 曾斌，张杰，廖爱军，等.瘦素与SB－431542干预大鼠肝星状细胞及其生物学活性的改变［J］.中国现代医学杂志，2012，22（29）：36－39.

［6］ 吕霞，舒建昌，付景，等.姜黄素对人肝星状细胞株LX－2瘦素和脂联素表达的影响［J］.广东医学，2013，34（11）：1641－1644.

［7］ 卢莺燕，王伟，周林福，等.血清瘦素水平在评估慢性病毒性肝炎肝纤维化程度中的意义［J］.浙江医学，2013（12）：1150－1152.

［8］ 朱净，潘亮，许晶，等.瘦素及Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白在肝纤维化大鼠肝组织中的变化［J］.基础医学与临床，2012，32（10）：1224－1225.