虎奶菇菌核多糖的溶液粘度及构象研究

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(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

虎奶菇菌核多糖的溶液粘度及构象研究

刘阿娟,张静*,张化朋,张鹏,梁涛,孙润广

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

用刚果红实验和圆二色光谱观察了不同条件下SHNP分子在溶液中的形貌特征,研究了不同溶液体系中虎奶菇菌核多糖SHNP的比浓粘度和粒度变化情况,以判断其分子的溶液构象。研究表明：温度、pH、变性剂、金属离子等外界条件均不同程度的影响SHNP溶液的比浓粘度；在pH为12时,SHNP聚集体的有效直径呈现最大化；刚果红实验和圆二色光谱分析表明,SHNP不具有三股螺旋结构,以无规线团链构象存在,pH、变性剂均可改变其构象。

多糖,构象,比浓粘度,圆二色光谱

虎奶菇,又称虎奶菌、核耳菇、茯苓侧耳、南洋茯苓等,学名菌核侧耳或地核侧(Pleurotus tuber-regium),为担子菌纲口蘑科侧耳属真菌,是一种珍稀食药用真菌,甘温,补气益血,治气血虚弱症[1],主要分布在我国云南省的腾冲和章凤等地,以及马来西亚、澳大利亚、尼日利亚和肯尼亚等,其中多糖是虎奶菇主要的活性成分,研究表明虎奶菇菌核多糖具有很好的抗肿瘤[2]、降血糖[3]、抗氧化[3]、降血脂[4]和抗病毒[5]活性,并有细胞的凝集作用[6],以及增强免疫力[7-8]等生物活性。多糖的生物活性主要取决于其理化性质、一级结构、高级结构和立体构型等[9-13],多糖生物活性与溶液的环境密切相关,因此多糖在不同溶液中的行为和分子链构象在活性发挥与构效关系上有着非常重要的生物学意义,值得深入研究。本文对热水提取的虎奶菇菌核多糖进行了分离纯化,通过刚果红实验、圆二色光谱(CD)、粘度法(Vis)研究了虎奶菇菌核多糖的溶液行为及构象[14-15],为虎奶菇多糖的构效关系研究提供了实验依据,具有重要的理论参考价值。

1. 材料与方法

1.1材料与设备

虎奶菇菌核多糖 本实验室提取制备；化学试剂均为分析纯。

HH-SA型恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司;Alphal-4型真空冷冻干燥机 德国CHRIST公司;乌氏粘度计 上海玻璃仪器一厂;JB-3型定时恒温磁力搅拌器 上海雷磁新泾仪器有限公司;激光粒度仪 美国布鲁克海文公司；圆二色谱仪 英国应用光物理公司。

1.2实验方法

1.2.1 虎奶菇菌核多糖的分离纯化 虎奶菇菌核粉碎、过60目筛,50℃烘干,95%乙醇脱脂,再置于50℃烘箱中烘干去除残留的乙醇,冷却至室温得到干燥的脱脂虎奶菇菌核粉。将其与蒸馏水以1∶30的固液比混合,在100℃下浸提2h,浸提2次,离心去上清液,透析,冷冻干燥得到棕色虎奶菇菌核粗多糖(HNP)。

称取200mg HNP,溶解于少许蒸馏水中,离心去除不溶物质后,将离心后的溶液上样于DEAE一52纤维素阴离子交换柱(2.5cm×80cm),洗脱液依次为：蒸馏水、0.05mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl,流速为每管600s,每管收集8mL左右,初步分级的组分依次命名为：WHNP、SHNP、SHNP1、SHNP2,分别依次按苯酚硫酸法[16]测每管的吸光值,合并单一峰组分,其中SHNP得率为最多。实验以含量最多的SHNP作为后期的研究目标,进而将其收集、透析、真空冷冻干燥以备后用。

称取100mg SHNP,溶于少许蒸馏水中,再离心,上清液上样于葡萄糖凝胶G-150(SephadexG-150),以蒸馏水为洗脱液,进一步分离纯化,流速为每管450s,每管收集3mL,进行苯酚硫酸法测定吸光值,合并单一峰组分,收集冷冻干燥,即得虎奶菇菌核多糖SHNP纯品。

1.3.2 纯度鉴定及单糖组成分析 对上述纯化后的SHNP进行紫外分光光度计检测;用高效液相色谱仪进行纯度鉴定及分子量测定：配制1mg/mL的上述糖液,20μL进样。采用气相色谱法进行单糖组分分析,按照文献[17]制备糖腈乙酰化衍生物以备气相色谱分析,进样量为0.1μL,通过样品的保留时间与标准品的保留时间相比较,确定SHNP的单糖组成。

1.3.3 溶液粘度的测定 对文献[18-19]的方法稍加改进,用乌氏粘度计测定不同温度、不同浓度、不同pH下SHNP的比浓粘度。依次配浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL的MgCl2、KCl、NaCl、CaCl2溶液以及浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的脲溶液测定SHNP溶液的比浓粘度。用乌氏粘度计在25℃测定SHNP的比浓粘度(ηsp)。

ηsp=(η/η0-1)/C

式中：η：待测溶液的粘度(mpa.s)；η0:2 0℃蒸馏水的粘度(mpa.s)；C:待测溶液的浓度(mg/mL)；ηsp：待测溶液的比浓粘度。

1.3.4 刚果红实验 配制2mg/mL的SHNP溶液,取2.0mL与等体积80μmol/L刚果红溶液均匀混合,依次加入不同体积的浓度为4mol/L的NaOH,使得NaOH的浓度从0mol/L逐渐升至0.5mol/L,室温下静置15min,在400～600nm范围内,用紫外可见分光光度计对其进行光谱扫描,记录下该溶液在不同NaOH浓度下的最大吸收波长。以不加多糖的刚果红溶液和NaOH各浓度的混合液做参比,以溶液中NaOH的浓度为横坐标,溶液的最大吸收波长为纵坐标作图[20]。

1.3.5 圆二色光谱(CD)测定 参照文献[21]方法,用圆二色光谱仪测定圆二色谱。将SHNP配制成1.0mg/mL的溶液与刚果红(80μmol/L)络合后测定CD谱,检测波长范围180～400nm。

1.3.6 粒度分布测定 配制质量浓度分别为0.01mg/mL,pH2、7、12的SHNP溶液,于室温下测其在635nm波长处粒度分布。观察在不同pH下SHNP分子的粒度分布变化。

2 结果与讨论

2.1 SHNP的纯度鉴定及其单糖组成

紫外光谱扫描结果如图1显示：SHNP在200nm处有糖类物质的特征吸收峰,在260nm和280nm无特征吸收峰,判断SHNP分子没有核酸和蛋白质。经高效液相色谱(如图2)分析,可以看到SHNP呈单一对称峰,进一步表明SHNP是均一多糖单一组分,其分子量经计算为：1.463×106u。气相色谱分析表明SHNP是只含葡萄糖的大分子葡聚糖,可用于进一步的结构分析和研究。

图1 SHNP的紫外光谱扫描

图2 SHNP的高效液相色谱图

2.2溶液比浓粘度测定结果

2.2.1 温度对SHNP溶液比浓粘度的影响 在不同的温度下保温30min后,测得的SHNP溶液比浓粘度见图3。由图3可知：温度从25℃升至35℃,该多糖溶液比浓粘度增长急剧,这是由于温度升高,使糖链活动能力增强,使其无规卷曲构象有所扩展,导致比浓粘度急剧增长,之后的35～65℃,随着温度的增高,溶液的比浓粘度下降。原因是热力作用破坏了多糖分子侧链间的氢键和离子键,使多糖的多聚体结构变为低聚体,聚合度的下降导致了比浓粘度下降,而在35℃升至40℃的过程中出现急剧减小的现象,说明这种热力破坏作用在此温度区间表现的更突出,在65～80℃时,SHNP的比浓粘度比较稳定,这说明在此温度区间,温度变化对其比浓粘度影响不大,多糖溶液在此温度区间的耐热性能比较好。

图3 温度对SHNP溶液比浓粘度的影响

2.2.2 浓度对SHNP溶液比浓粘度的影响 在25℃,将不同浓度的SHNP溶液恒温30min,SHNP溶液比浓粘度结果见图4。随着浓度的增大,SHNP多糖的比浓粘度总体上逐淅增大,但在低浓度时(1～3mg/mL),浓度对其比浓粘度几乎没影响,浓度超过3mg/mL后,溶液的比浓粘度以较大的幅度增长。这是因为随着溶液中主要的粘稠物质为高分子SHNP,随着其含量的增加,多糖分子相互联结、聚合的程度增加,溶液的比浓粘度越大,这种现象符合一般高分子溶液的粘度特性[22]。

图4 浓度对SHNP溶液比浓粘度的影响

2.2.3 变性剂脲对SHNP溶液比浓粘度的影响 在SHNP溶液中加入不同浓度的脲,恒温30min后,由图5可知：脲浓度在0.1～0.4mg/mL范围内,随着浓度的增加,其比浓粘度呈减小趋势,在0.4～0.6mg/mL浓度范围内,其比浓粘度又呈现增加的态势,之后随着脲浓度的增加其比浓粘度又减小。即加入的变性剂量的不同对多糖分子构象的影响不同。这可能是变性剂在一定剂量下,会造成SHNP一些氢键断裂,葡聚糖分子结构有所收缩或伸展,使其构象不稳定,导致溶液比浓粘度减小或增大[23]。

2.2.4 pH对SHNP溶液比浓粘度的影响 图6可知,SHNP溶液在酸性及碱性条件下,其比浓粘度比中性条件下都有所下降,在酸性条件下其比浓粘度变化不大,但碱性条件变化更突出一些。这是由于氢离子和氢氧根离子对多糖的侧链均有一定的破坏作用,氢氧根离子的作用更强些。因此酸、碱度的增加都会使多糖聚合度减小,从而降低了其比浓粘度,而在酸性条件下,其比粘度基本不变,说明了SHNP的构象在酸性条件下比较稳定。

图5 脲对SHNP溶液比浓粘度的影响

图6 pH对SHNP溶液比浓粘度的影响

2.2.5 金属盐离子对SHNP溶液比浓粘度的影响 图7说明,不同浓度的Na+、Mg2+、Ca2+的存在均可使SHNP溶液的比浓粘度有不同程度的增加,K+对其比浓粘度几乎没影响。随着Mg2+、Na+浓度的增加,其比浓粘度呈增长态势,而Ca2+则在浓度为0.5mol/L时,多糖的比浓粘度达到最大。这可能由于多糖分子链中存在的羟基与某些金属离子发生络合作用,形成蛋箱结构[24],构象变化导致溶液比浓粘度增加；还可能是由于SHNP本身分子量很大,引起比浓粘度增大。

图7 金属离子对SHNP溶液比浓粘度的影响

2.3虎奶菇菌核多糖SHNP构象的初步判定

刚果红实验是研究多糖大分子构象的一种有效方法。刚果红是一种酸性染料,可与具有三股螺旋构象的多糖形成配合物,其紫外最大吸收波长能使刚果红本身紫外最大吸收波长发生红移,且在一定的NaOH 浓度范围内,配合物出现亚稳区即络合物的紫外最大吸收波长急剧下降。实验结果如图8所示：NaOH浓度在0～0.5mol/L范围内变化期间,WHNP与刚果红形成的络合物,其紫外最大吸收波长虽也发生红移,但最大吸收波长增长的缓慢,并没有发生急剧下降的现象,即未曾出现亚稳态区,这说明虎奶菇菌核多糖SHNP不具有三股螺旋结构[25]。与右旋糖酐无规线团链构象类似[26],说明SHNP在水溶液中以呈无规线团(random coil)链构象存在。

图8 虎奶菇菌核多糖SHNP-刚果红络合物的 最大吸收波长变化

2.4圆二色光谱(CD)分析SHNP构象

2.4.1 Ca2+添加对SHNP多糖构象的影响 圆二色光谱(CD)是一种差光谱,是样品在左右旋偏振光照射下的吸收光谱差值。由于生物大分子基本都含有手性的基团和结构,因此圆二色光谱可以帮助测量和观察生物大分子的结构和构象变化,圆二色谱对构象变化很敏感,它可灵敏地检测一些反应引起的构象变化,是研究多糖三维结构的有效方法之一。多糖的圆二色性与其分子的结构和构象存在一定关系。由图9可知,Ca2+使得多糖溶液的圆二色谱正峰峰强度减弱,负峰强度增强,但各正负峰的最大吸收位置没有变化,在191nm附近正峰的峰面积略有减小,揭示了由于钙离子的参与,多糖分子间通过Ca2+桥键使多糖空间的手性减小,SHNP链变得较柔顺,链的对称性减小,但基本构象未发生改变[27]。

图9 Ca2+处理的SHNP的圆二色谱

2.4.2 刚果红对SHNP构象的影响 结果见图10。刚果红的加入使得多糖图谱在192nm处正峰减弱,214nm处负峰也有所减弱,位置未发生改变,其它各处的峰值几乎无任何变化,没有发生Cotton效应,表明SHNP与刚果红发生了络合反应,但未能其形成有多股螺旋的特征络合物,进一步也揭示了前面的刚果红实验。SHNP不存在具有多股螺旋的构象,以无规线团链构象存在于溶液中。

图10 刚果红处理的SHNP的圆二色谱

2.4.3 二甲基亚砜(DMSO)对SHNP多糖构象的影响 圆二色光谱图(CD)显示：DMSO的加入使其图谱出现了突然一个高峰(或一个低谷)紧接着又一个低谷(或高峰)的Cotton效应[28-29]DMSO的入在很大程度上破坏了多糖分子内和分子间氢键相互作用,增加了多糖分子(C-O和O-H)的不对称性,使得多糖分子的圆二色谱发生较大变化,揭示了DMSO的参与使得SHNP构象发生较大变化。

图11 二甲基亚砜处理的SHNP的圆二色谱

2.4.4 pH对多糖构象的影响 圆二色谱图(CD)显示：在pH2时只是峰的强弱发生了稍许的变化,其他位置基本不变,而在pH12条件下,正峰强度显著增强,负峰位置及强度也发生了变化,这很可能是由于碱性条件下使得分子间或分子内的氢键键和作用发生改变导致的,说明了SHNP多糖在酸性条件下结构相对稳定,而碱性条件可能会使其构象发生改变。

图12 不同pH处理下SHNP的圆二色谱

2.5 SHNP的粒度分布分析

激光粒度分布测定结果显示：不同pH下,SHNP粒度分布不同,SHNP多糖聚集体大小依次为：碱性>中性>酸性,其中在酸性与中性环境中的聚集体的有效直径接近,说明酸性环境对此多糖分子间及分子内的相互作用影响比较小,而碱性环境影响较大,使其分子间或分子内的作用增强,使其构象结构发生变化,从而聚集作用比较显著。

表1 不同pH时的粒度分布变化

3 结论

虎奶菇菌核多糖的比浓粘度,在温度未达35℃之前,其随温度的升高而增大,超过35℃,比粘度随温度的升高而减小,由于热力作用破坏了多糖分子侧链间的氢键和离子键,使多糖的多聚体结构变为低聚体,聚合度的下降导致了粘度下降；SHNP溶液的比浓粘度总体上是随着其浓度的增大而增大,这可能由于随着多糖分子含量的增大,分子相互联结、聚合程度增加,溶液的粘度越大；SHNP溶液的比浓粘度在中性条件下为最大,酸碱性的升高均可使其比粘度减小,这是由于氢离子和氢氧根离子对多糖的侧链均有一定的破坏作用,使多糖聚合度减小,从而降低了其比粘度;Na+、Ca2+及Mg2+的加入均可使SHNP的比粘度升高,而K+对其影响的程度很小。这说明多糖分子链中存在的羟基与某些金属离子发生络合作用也会对糖比粘度的有影响。圆二色谱和刚果红实验表明：虎奶菇菌核多糖SHNP不具三股螺旋链构象,为无规线团链构象。随着溶液环境的变化,SHNP具备不同的存在形态。不同pH溶液,变性剂DSMO(脲)的加入均可使其构象发生改变。

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Research of the solution viscosity and conformation character of polysaccharide from the mushroom sclerotia of pleurotus tuber-regium

LIUA-juan,ZHANGJing*,ZHANGHua-peng,ZHANGPeng,LIANGTao,SUNRun-guang

(College of Food Engineering and Nutrition Science,Shannxi Normal University,Xi’an 710062,China)

Congo-red reaction and the technique of CD were used to observe morphology of polysaccharides(SHNP)from Pleurotus tuber-regium. Inherent viscosity and the particle size distribution changes of the SHNP in different solution were studied to determine conformation of SHNP in solution. The results indicated that:the external conditions such as temperature,pH,denaturants and metal ions etc could affect SHNP to differ extent. The particle size of SHNP became bigger in the addition of NaOH. Congo-red reaction and the technique of CD showed that SHNP did not have the triple helix structure,while it was a random coil chain conformation,pH and denaturants could cause the SHNP conformation change.

polysaccharides;pleurotus tuber-regium；conformation；inherent viscosity;circular dichrosim spectroscopy

2013-03-11 *通讯联系人

刘阿娟(1986-),女,硕士,主要从事天然产物有效成分的化学研究。

国家自然科学基金(10874108)；陕西省自然科学基础研究计划(SJ08A16)资助。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0128-05