肿节风注射液联合5-Fu对人胃癌细胞MGC-803增殖和凋亡的影响

何志坚 钟 睿 刘海云

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率居高不下，严重威胁人类的生命健康[1]，5-氟尿嘧啶(5-Fu) 是临床上治疗肿瘤的常用化疗药物，对肿瘤有一定的疗效，但其不良反应大，如骨髓抑制、口腔黏膜炎和外周神经毒性等，甚至可引起急性心肌梗死和心源性休克，还可引起脑血管缺血[2]。有报道指出:中药联合化疗药物能显著增强抗肿瘤细胞的增殖生长、降低化疗药物的不良反应[3]，本实验通过肿节风注射液联合应用5-Fu，探讨他们对抗人胃癌 MGC-803细胞增殖、粘附、凋亡和细胞周期的影响，为临床治疗肿瘤用药开发和联合用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂

肿节风注射液(剂量为生药量)，规格：1 g/mL，2 mL/支，批号：20120618，福建古田药业有限公司生产；MGC-803细胞株购自南京凯基生物公司；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司，批号755295)；小牛血清(杭州四季青生物工程研究所，批号 20120502)；二甲基亚砜(DMSO，上海生物工程公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国 Sigma 公司)；Trypsin，Solarbio(批号 T8150)；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物，批号 KGA106)；氟脲嘧啶(上海旭东海普药业有限公司，批号 H31020593)。

1.2 仪器

酶标仪550(BIO-RAD)；空气净化台(苏州三兴净化科技有限公司)；EPICSXL-流式细胞仪(美国贝克曼特公司)；台式离心机(Eppendorf 公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 人胃癌细胞MGC-803培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，细胞在相对湿度为95%、37 ℃、5%CO2的环境中贴壁生长，取对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 MTT检测MGC-803细胞增殖抑制率 取对数生长期的MGC-803细胞，胰酶消化，细胞计数板计数并调整细胞悬液浓度达到1×105/mL，每孔加入100 μL细胞液于96孔培养板中，37 ℃、5%CO2过夜培养至细胞完全贴壁。待细胞贴壁后取出，随机分为4 组，即中药ZJF组、5-Fu 组、ZJF+5-Fu组及对照组，按实验设计，加入不同浓度的药物，每种药物浓度设5个复孔，中药ZJF组中药浓度分别为 6.25、12.5、25、50 mg/mL，5-Fu 组5-Fu浓度分别为 0.0125、0.0250、0.0500、0.1000 mg/mL；按照实验设计原则，中药ZJF+5-Fu组为中药ZJF与5-Fu各自的最终浓度均需与单一用药组一致。以双倍浓度的ZJF及5-Fu等体积混合，即得到ZJF+5-Fu组药物浓度分别为6.2625、12.525、25.05、50.10 mg/mL，对照组加入单纯培养液，分别培养24、48、72 h后，每孔加20 μL MTT继续培养4 h，弃上清每孔加入150 μL DMSO,室温低速震荡10 min,待结晶物溶解后,于酶标免疫测定仪测定490 nm处的吸光度D值。肿瘤细胞生长抑制率=(1-实验组平均D值/对照组平均D值)×100%。

1.3.3 MTT法检测MGC-803细胞粘附能力 将细胞种入直径6 cm小皿中，4组细胞数为1×105/皿、贴壁后，按实验设计，加入含不同浓度药物的 RPMI1640培养液，培养24 h后，消化细胞，离心重悬，保留小皿内含药培养液，用含药培养液将细胞密度调至1×106个/mL，接种于96孔板，1×105个/孔，每种密度设3个复孔；对照组加入无药物的RPMI 1640培养液，常规培养20、40、60 min，吸出培养液，用灭菌PBS小心清洗，每孔2次，洗去未黏附细胞；每孔加入100 μL 10%小牛血清 RPMI 1640+20 μL MTT，继续培养4 h，弃去全部上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡器振荡10 min，使结晶完全溶解，在酶联仪波长490 nm处测出各孔A，以A 代表黏附细胞数。重复实验。

1.3.4 流式细胞仪检测MGC-803细胞凋亡 取对数生长期的胃癌细胞消化、计数，将4组细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，每组细胞设4个复孔。然后按实验设计，加入不同浓度的药物。各处理组所加药物浓度为 MTT 法计算所得0.1×IC50。37 ℃孵育48 h后，采用Annexin V-FITC 法检测癌细胞凋亡，消化各实验组细胞，收集于EP管中，PBS洗涤2次，用250 μL结合缓冲液重悬细胞，取195 μL的细胞悬液加入5 μL AnnexinV/FITC后，加入5 μL 20 μg/mL的PI(碘化丙锭)溶液室温避光孵育15 min，转入流式管中应用流式细胞仪(FACScan，BD公司，美国)分析。

2 结果

2.1 各组对MGC-803细胞增殖抑制率的影响

ZJF、5-Fu 单用及合用均对MGC-803细胞有抑制作用，其抑制率与药物浓度呈正相关。ZJF+5-Fu组对细胞增殖抑制率明显高于5-Fu 组和ZJF组(P<0.05)，见表1。

表1 各组作用不同时间对MGC-803细胞抑制率的影响(﹪，

注：与ZJF+5-Fu组同浓度同时间点比较，①为P<0.05，②为P<0.01。

2.2 各组对MGC-803细胞粘附的影响

结果表明:ZJF组、5-Fu 组及ZJF+5-Fu组作用20、40、60 min 后，实验组各时间点细胞粘附率均明显低于空白对照组，而ZJF+5-Fu组细胞粘附率明显低于5-Fu 组和ZJF组(P<0.05)，且作用时间越长，细胞粘附能力的抑制作用越强，见表2。

2.3 各组对MGC-803细胞凋亡率情况

各实验组凋亡率与对照组比较显著升高；同一时间段2种药物合用后细胞凋亡率均较相应浓度单药凋亡率高(P<0.05，P<0.01)。实验结果显示，肿节风注射液与5-Fu联合用药后对胃癌细胞的凋亡有明显增强作用，见表3。

表2 各组对MGC-803细胞粘附能力的影响

注：与对照组同时间点比较,①为P<0.05，②为P<0.01；与ZJF+5-Fu组同时间点比较,③为P<0.05,④为P<0.01。

表3 各组不同时间点MGC-803细胞凋亡率情况 ﹪)

注：与对照组同时间点比较，①为P<0.05，②为P<0.01；与ZJF+5-Fu组同时间点比较,③为P<0.05,④为P<0.01。

3 讨论

化疗是治疗胃癌及胃癌术后的主要方法之一，而大剂量的药物联合化疗，在治疗癌症病灶的同时，会引起机体的不良反应，同时降低了机体的免疫力，制约了药物的治疗效果。因此，在化疗的过程中，维护机体的免疫状态和抗癌化疗同样重要。中医治疗是从整个机体出发，调整全身各系统、器官和组织的功能状态，增强了因化疗药物使机体功能低下的免疫系统，间接对肿瘤细胞起抑制与杀伤作用，达到治疗目的[4]。因此，中药联合化疗药增强机体免疫作用而达到抗肿瘤作用，同时还能降低骨髓抑制和消化道不良反应的发生，在改善中晚期胃癌患者的生活质量，延长患者的生存期的应用中具有重要意义[5]。

肿节风(ZJF)为金粟兰科多年生草本植物草珊瑚的枝叶，内含多种抗肿瘤有效成分[6]。5-Fu为1种嘧啶类似物，可在细胞内转化成不同的细胞毒性代谢产物，与DNA和RNA结合，最终通过抑制DNA合成导致细胞周期停滞和细胞凋亡，当肿节风注射液与5-Fu等化疗药物联用时具有协同作用。MTT法检测肿节风注射液联合5-Fu对人胃癌MGC-803细胞增殖抑制作用，根据实验结果来看肿节风注射液可抑制MGC-803细胞生长且具有明显的时效和量效关系，即浓度越大，作用时间越长，抑制作用也就越强。

本研究结果显示肿节风注射液对MGC-803胃癌细胞有明显的诱导凋亡作用。作用48 h后，凋亡率随中药浓度的增加明显升高，肿节风注射液与5-Fu联合用药比单独使用效果更好，其机制可能与下调Bcl-2基因的表达，上调野生型P53基因表达有关。

总之，本研究结果表明肿节风注射液与5-Fu联合应用能进一步提高化疗药物疗效，对胃癌细胞系MGC-803具有时间和浓度依赖性的抑制作用，抑制作用与抑制DNA合成和诱导凋亡有关，有关的分子机制有待进一步深入研究。

[1] 崔建成.奥沙利铂、氟尿嘧啶联合亚叶酸钙治疗晚期胃癌效果观察〔J〕.山东医药,2010,50(51):85-86.

[2] Frickhofen N，Beck FJ，Jung B，et al.Capecitabine can induce acute coronary syndrome similar to 5-fluorouracil〔J〕.Ann Oncol，2002，13(5):797-801.

[3] 丁照黎.中西医结合对肿瘤放化疗患者的临床影响观察与分析〔J〕.中国实用医药,2011,6(7):185-186.

[4] 张国臣.胃癌术后化疗联合中医治疗研究进展〔J〕.实用中医内科杂志,2011,25(8):28-31.

[5] 刘燕珠.中西医结合治疗中晚期胃癌临床效果分析〔J〕.中医临床研究,2011,3(16):22.

[6] 赵长琦，许有玲.抗肿瘤植物药及其有效成分〔M〕.第1版.北京：中国中医药出版社，1997:119-120.