AB-8大孔树脂对芫荽黄酮的纯化工艺研究

王珊珊，吴 春

(哈尔滨商业大学 食品工程学院,哈尔滨150076)

芫荽(Coriandrum sativum L)又名胡荽，俗称香菜.芫荽属伞形科植物，是一年生香叶类蔬菜，是人类历史上用于药用和调味食品中最古老的芳香蔬菜之一[1].芫荽主要含有蛋白质、多糖、维生素C、挥发油、黄酮甙、油酸等化学成分.具有芳香健胃、祛风解毒的功效.

黄酮类化合物(Flavonoid)，又称生物类黄酮，广泛分布于植物界，具有多种生物学活性，主要包括抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等[2]，可作为合成抗氧剂如BHT、BHA等替代品，具有高效、低毒等特点[3].

大孔树脂是一类有较好吸附性的有机高聚物，主要由吸附作用使化学物质产生分离.近年来广泛应用于植物中活性成分的分离，它具有吸附量大、稳定性高、选择性强、再生简便、使用周期长、节约费用等优点[4].本文选择AB-8大孔树脂对芫荽中总黄酮进行纯化，并对其静态和动态吸附解吸条件进行了研究，为今后芫荽中黄酮类化合物的应用和开发作出一定的参考.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

新鲜芫荽购买于哈尔滨市菜市场，将芫荽茎叶清洗并晾干，60 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎磨粉过筛(60目)，将芫荽样品放入磨口广口瓶，置于干燥器中保存，备用.

芦丁标准品(中国药品集团上海化学试剂公司，纯度95.0 %)，AB-8型大孔树脂(天津市光复精细化工研究所)，无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司)，36%-38%盐酸，石油醚，NaNO2，Al( NO3)3，NaOH等试剂均为分析纯，

1.2 仪器与设备

DFY型摇摆式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，DHG-9123A型电恒温热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)，FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，721E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，pHS-25型酸度计(上海伟业仪器厂)，SHZ-A水浴振荡器(上海申胜生物技术有限公司)，R-205旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法[5].在最大吸收波长510 nm处测定吸光度，以芦丁质量质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线.

1.3.2 芫荽总黄酮粗提液的制备

精确称取一定量芫荽粉末，在乙醇体积分数40%，料液比1∶30，超声时间40 min，超声温度65 ℃，超声功率96 W的条件下进行提取，提取液通过真空抽滤后，收集滤液，将滤渣按以上条件再提取两次，合并滤液，旋转蒸发至无乙醇气味时，用等体积的石油醚萃取3次，用来除去脂肪.经旋转蒸发至粉末状，收集芫荽总黄酮的粗提物.

1.3.3 大孔树脂的预处理

取适量干大孔树脂用95%的乙醇充分浸泡24 h后，通过真空抽滤除去乙醇并用蒸馏水洗至无乙醇味.将树脂用5%HCl浸泡4 h，用蒸馏水漂洗至中性过滤后，再用5%NaOH浸泡4 h，用蒸馏水充分漂洗至中性，过滤.浸泡于蒸馏水中，备用.

1.3.4 大孔树脂对芫荽总黄酮的静态吸附实验

1)静态吸附动力学曲线

精确称取已经处理好的大孔树脂2 g，真空抽滤至不滴水为止，加入到250 mL磨口三角瓶中，加入初始质量浓度为0.209 mg/mL的黄酮粗提液100 mL，在25 ℃的条件下恒温水浴震荡，每隔30 min取样一次，测定总黄酮质量浓度，绘制动力学曲线，确定合理的吸附时间.

2)静态解析动力学曲线

取吸附饱和的树脂，加入50%的乙醇溶液100 mL，置于25 ℃的条件下恒温水浴震荡器上，每隔30 min取样1次，测定总黄酮质量浓度，绘制动力学曲线，确定合理的解析时间.

1.3.5 大孔树脂对芫荽总黄酮的动态吸附实验

称取一定量经预处理的大孔树脂，采用湿法装柱将其装入层析柱中，准确量取芫荽黄酮提取液，分别缓慢地加入到层析柱中，选取上样流速、样液质量浓度、解析流速、解析剂质量浓度四个因素进行实验，收集吸附后样液，测定吸附后样液及洗脱液的吸光度值，分别计算大孔树脂动态吸附实验的吸附率和解析率.

其中：C0为吸附前样液质量浓度(mg/mL)；C为吸附后滤液质量浓度(mg/mL)；C1为洗脱液质量浓度(mg/mL)；V为萃取液体积(mL)；V1为洗脱液体积(mL).

1)上样液pH值对吸附效果的影响

称取预处理好的大孔树脂10 g，采用湿法装柱，加入配制好的粗提液5份，调节pH值为4、5、6、7、8，测定流出液的吸光度值，计算吸附率.

2)上样液质量浓度对吸附效果的影响

称取预处理好的大孔树脂10 g，采用湿法装柱，上样速度为1 mL/min，分别加入相同pH值和相同量的质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL粗提液，收集流出液，测定其吸光度值，计算吸附率.

3)上样液流速对吸附效果的影响

称取预处理好的大孔树脂10 g，采用湿法装柱，控制上样速度为1、2、3、4、5 mL/min，将同一质量浓度相同量的粗提液加入层析柱中，收集流出液，测定其吸光度值，计算吸附率.

4)洗脱剂体积分数对解析效果的影响

吸附饱和的大孔树脂，调节流速为1 mL/min，分别用4倍柱床体积的体积分数为50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液进行洗脱，收集流出液，测定其吸光度值，计算解析率.

5)洗脱剂流速对解析效果的影响

吸附饱和的大孔树脂，调节流速为1、2、3、4、5 mL/min，用70%的乙醇溶液50 mL进行洗脱，收集流出液，测定其吸光度值，计算解析率.

2 结果与讨论

2.1 总黄酮标准曲线

将实验结果进行线性回归，得回归方程和相关系数为R2=0.999 6.结果表明，在芦丁质量浓度为0.008～0.040 mg/mL时线性关系良好.见图1.

图1 芦丁标准曲线

2.2 大孔树脂对芫荽总黄酮的静态吸附性的研究

2.2.1 静态吸附平衡时间的确定

由图2可以得到，随着吸附时间的延长，总黄酮质量浓度逐渐下降.当吸附时间达到3 h后，总黄酮质量浓度随时间变化趋于平缓，吸附量逐渐达到饱和，故选择3 h为静态最佳吸附时间.

图2 大孔树脂静态吸附曲线

2.2.2 静态解析平衡时间的确定

由图3可知，随着解析时间的增加，总黄酮质量浓度逐渐上升.当解析时间达到1.5 h质量浓度达到最大，之后随着时间的延长，黄酮质量浓度基本保持不变，因此，选择1.5 h为大孔树脂静态最佳解析时间.

图3 大孔树脂静态解析曲线

2.3 大孔树脂对芫荽总黄酮的动态吸附性的研究

2.3.1 上样液pH值对吸附效果的影响

由图4可以看出，pH值在4～6呈上升趋势，pH值大于6后吸附率开始下降，在pH值为6时有较大的吸附率.这是因为黄酮类化合物为多羟基酚类，多显酸性，在酸性或弱酸的条件下能达到较好的吸附效果[6].所以，本实验的中上样液pH值为6.

图4 pH值对吸附效果的影响

2.3.2 上样液质量浓度的确定

由图5可知，随着上样液质量浓度的升高吸附率逐渐降低，在质量浓度为1.0 mg/mL时吸附率最高，原因是黄酮质量浓度较高时，不能被充分吸附，导致吸附率较低.所以，最适合上样质量浓度为1.0 mg/mL.

图5 上样液质量浓度对吸附效果的影响

2.3.3 上样液流速的确定

由图6可知，随着上样液流速的增加，大孔树脂对黄酮的吸附率先上升后开始下降，流速在1～2 mL/min时吸附率较高，原因是流速较快时大孔树脂对黄酮吸附不充分.因此，综合吸附率和实验时间选择2 mL/min为最佳上样流速.

图6 上样液流速对吸附效果的影响

2.3.4 洗脱剂体积分数的确定

由图7可以得到，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮的解析率逐渐增大，当乙醇体积分数达到70%时达到最大解析率，超过70%时解析率有略微的下降，综合解析率和节约药品选择70%为最佳洗脱剂体积分数.

图7 乙醇体积分数对洗脱率的影响

2.3.5 洗脱剂流速的确定

由图8可以看出，洗脱剂流速在1～2 mL/min时解析率变化不大，超过2 mL/min时解析率快速下降，此时，解吸流速过快，吸附在树脂上的物质来不及解吸，所以洗脱不完全.解吸流速过慢，会延长实验周期，增加成本[7-8].因此，综合洗脱率和洗脱时间选择2 mL/min为最佳洗脱流速.

图8 洗脱剂流速对洗脱率的影响

3 结 语

AB-8大孔树脂对芫荽黄酮提取液吸附平衡时间为1.5 h，解析平衡时间为3 h.当芫荽黄酮进样液pH值为6.0、进样质量浓度为1.0 mg/mL、进样速率为2 mL/min时，AB-8对芫荽黄酮的吸附率较大.洗脱时使用4倍柱床体积的体积分数70%乙醇溶液，当洗脱剂流速为2 mL/min时，AB-8树脂对芫荽黄酮的洗脱率较高.

参考文献：

[1] 赵秀玲.芫荽的成分及保健功能的研究进展[J].食品工业科技,2011,32(4):427-429.

[2] 耿敬章,冯君琪.黄酮类化合物的生理功能与应用研究[J].中国食物与营养,2001(7):19-21.

[3] 宋 惠,李 勇.黄酮类化合物的保健作用[J].中国食物与营养，2004(11):45-47.

[4] 徐 青,卢莹莹,辛建美，等.大孔树脂吸附分离海芦笋中黄酮类化合物工艺[J].食品科学,2011,32(2):115-119.

[5] 王恩福.蓝靛果中黄酮类化合物的提取纯化及功能的研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2007.

[6] 刘延吉,孙素梅,王学密，等.AB-8型大孔树脂分离纯化南果梨黄酮类化合物的研究[J].食品工业科技,2008,29(2):68-70.

[7] 戴文娟，郭璇华.大孔树脂吸附纯化火龙果茎黄酮类化合物的研究[J].食品研究与开发,2009,30(11):65-68.

[8] 陆海莲，吴 春，刘 宁.AB-8大孔树脂对黑米花色苷的吸附性能研究[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2013，29(1)：93-96.