解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾组织基质金属蛋白酶-9、金属蛋白酶组织抑制剂-1表达的影响

邢 磊 焦颖华 田发明

(河北联合大学附属医院老年病科，河北 唐山 063000)

糖尿病肾病(DN)是终末期肾病的主要病因，并且是糖尿病(DM)患者死亡的主要原因之一〔1，2〕。细胞外基质(ECM)合成及降解失衡在DN肾小球硬化中发挥重要作用〔3，4〕。基质金属蛋白酶(MMP)及基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)系统是参与ECM降解的主要酶系，本研究旨在探讨解聚复肾宁(JJFSN)对DM大鼠肾组织MMP-9及TIMP-1表达的影响，以探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1药物及试剂 链脲佐菌素(STZ)为ALEXIS公司产品；JJFSN由黄芪、生地黄、黄连、黄芩、丹参、葛根等12味中药组成，制备成浓缩口服液，含生药2 g/ml；厄贝沙坦为杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司产品。MMP-9、TIMP-1兔多克隆抗体、山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体免疫组化检测试剂、DAB显色剂均为北京中杉金桥有限公司产品。

1.2实验方法

1.2.1动物分组、模型的建立及给药 选择8 w龄体重200～220 g的健康雄性SD大鼠70只。用随机数字表法将大鼠分为正常对照组10只和造模组60只。造模组用0.1 mmol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.2，4℃)将STZ配成2%的溶液，大鼠禁食12 h后，按STZ 60 mg/kg剂量，左下腹腔单次注射。注药后72 h尾尖取血测空腹血糖(FPG)，血糖≥16.65 mmol/L者确定为DM成模大鼠，共成模51只。将成模DM大鼠随机分成4组：模型组13只、JJFSN组13只、厄贝沙坦组12只、JJFSN+厄贝沙坦组13只。正常对照组大鼠腹腔注射等量无菌枸橼酸钠缓冲液，尾尖取血测血糖，血糖4.7～8.3 mmol/L者为正常，共10只。造模7 d后，JJFSN组用JJFSN按14.9 ml·kg-1·d-1灌胃；厄贝沙坦组用厄贝沙坦按50 mg·kg-1·d-1灌胃；解聚复肾宁+厄贝沙坦组用解聚复肾宁按14.9 ml·kg-1·d-1和厄贝沙坦按50 mg·kg-1·d-1灌胃。每日上午1次，正常对照组和模型组大鼠每日上午用等量蒸馏水灌胃。室温18～20℃，相对湿度69%，12 h交替照明，大鼠自由饮水、进食。共喂养12 w。

1.2.2标本采集 实验结束前1 d，用代谢笼留取24 h尿液，记录总量，离心，-80℃冰箱保存。实验结束，所有动物于空腹状态称体重(BW)，10%水合氯醛腹腔麻醉，心脏取血，分离血清，-80℃冰箱保存；剖腹分离双侧肾脏，右肾用冰生理盐水清洗，吸干水分，称肾重(KW)，左肾取少部分皮质制备1 mm3数块，用4%戊二醛固定，待做透射电镜观察，取1/2肾组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，待行病理和免疫组化。

1.2.3生化指标检测方法 血糖、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24 h尿白蛋白排泄率(UAER)用ROCHE MODULAR全自动生化分析仪测定。

1.2.4免疫组织化学方法 将石蜡包埋的肾组织制成厚4 μm切片，按照免疫组化二步法检测肾组织MMP-9、TIMP-1的表达。以PBS代替一抗作为阴性对照。每个标本在400倍光镜下随机选取8个视野，采用Olympus公司图像采集系统及北航医学图像分析管理系统进行半定量分析，染色阳性部位的深浅以平均光密度值表示。

2 结 果

2.1各组大鼠一般状态、BW、KW/BW和FPG比较 见表1。成模大鼠均出现多饮、多食、多尿、消瘦、毛发枯黄无光泽等DM表现，部分出现肢体感染、溃疡和白内障等并发症。模型组大鼠上述症状明显，死亡3只，考虑死因为血糖过高引起酮症酸中毒或感染，JJFSN组、厄贝沙坦组、JJFSN+厄贝沙坦组大鼠上述症状较轻，JJFSN组、厄贝沙坦组、JJFSN+厄贝沙坦组因灌胃各死亡2只。

2.2各组大鼠BUN、Scr和UAER比较 见表2。模型组与正常对照组比较，BUN、Scr、UAER均显著增高，JJFSN组、厄贝沙坦组、JJFSN+厄贝沙坦组与模型组比较，BUN、Scr、UAER均明显降低，JJFSN+厄贝沙坦组降低最显著(P<0.01)，JJFSN组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组大鼠肾脏形态学观察 电镜下，正常对照组大鼠足突细长整齐，基底膜厚度适中；模型组大鼠肾脏系膜区可见高电子密度沉积物，基底膜明显增厚,足突融合；JJFSN组、厄贝沙坦组、JJFSN+厄贝沙坦组上述改变明显轻于模型组。

2.4各组大鼠MMP-9、TIMP-1表达 见表2。正常对照组大鼠肾组织中均有明显MMP-9表达，在肾小球、肾小管及间质可见明显的棕黄色强阳性染色区；模型组MMP-9仅为弱阳性表达；JJFSN组MMP-9的表达较DM模型组强，为阳性表达，但较正常对照组弱，JJFSN组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义(P>0.05)，JJFSN+厄贝沙坦组较JJFSN组、厄贝沙坦组表达上调更为显著(P<0.01)。TIMP-1在正常对照组大鼠肾组织中可见少量棕黄色染色，为弱阳性表达；在模型组，肾小球、肾小管及间质均可见大量棕黄色染色，TIMP-1表达强阳性：JJFSN组TIMP-1的表达较正常对照组强，但较DM模型组弱，为阳性表达，JJFSN组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义，JJFSN+厄贝沙坦组较其他治疗组表达下调更为显著(P<0.01)。

表1 12 w后各组大鼠FPG、BW、KW、KW/BW变化情况

表2 12 w后各组大鼠BUN、 Scr、 UAER及肾组织MMP-9、TIMP-1平均光密度值

3 讨 论

DM是以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病，DM及其慢性并发症的发生发展，与众多细胞因子和酶活性的改变有关，DM导致的代谢异常可引起基底膜结构和功能发生改变，这些改变可使组织血管基底膜的降解与重构机制发生异常，而ECM作为血管壁的主要成分在这些生理病理过程中发挥重要作用。正常情况下，ECM处于不断产生和不断降解的动态平衡中，涉及ECM代谢最主要的酶系是MMPs/ TIM Ps。MMPs是一组具有类似结构和共同生物化学性质的金属依赖性蛋白水解酶超基因家族，是ECM的主要降解酶系统，能降解除多糖以外的所有ECM成分，如胶原和弹性蛋白，其活性受TIMPs的调节。TIMPs为MMPs特异性组织抑制因子，能特异性与MMPs催化中心的Zn2+结合，封闭其催化活性。MMPs调节紊乱与DM的发生密切相关。生理状态下MMPs/TIMPs处于一种动态平衡，共同维持ECM的正常代谢，而在DN时，由于高血糖、血脂代谢紊乱及蛋白非酶促糖基化作用等，这种平衡被打破，导致TIMPs表达上调和或MMPs表达下调，均可致ECM的合成增加，降解减少，而堆积〔5〕。其他细胞因子如TGF-β1不但可刺激基质成分合成增加，也可通过上调TIMPs表达、抑制MMPs表达，或使其活性降低，影响细胞外基质的正常代谢，导致ECM的积聚〔6〕。

而在众多MMPS家族成员中，MMP-9能够降解肾脏组织明胶和基底膜胶原，TIMP -1是MMP-9特异性的抑制因子，因此MMP-9及TIMP-1可能与DN的发生、发展最相关。研究认为，MMP-9可能通过两种机制导致肾小球损伤：①诱导系膜细胞由静止表型转变为炎症表型，出现快速增殖，表达新型蛋白，合成ECM增多，导致系膜基质堆积〔7〕；②可降解基底膜，破坏细胞与基质的正常连接，致肾小球正常结构破坏，影响肾小球ECM的重塑，促进蛋白尿的发生〔8〕。TIMP-1与MMP-9以1：l比例非共价键结合形成MMP-9-TIMP-1复合体，阻断MMP-9与底物的结合和活化，两者共同参与细胞外基质的降解过程〔9〕。Karamessinis等〔10〕研究发现高糖环境下人类近端肾小管上皮细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达下降，TIMP-1 mRNA表达升高，且2型糖尿病(T2DM)伴蛋白尿患者MMP-9和MMP-2释放减少，表明局部MMP/TIMP失衡参与DM肾组织的重建过程。研究证实，重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)可增加组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1、TIMP-3(尤其是TIMP-1)的表达，然而TIMP-1的增多则会抑制MMP-9的作用，从而阻止细胞外基质的降解〔11〕。

本实验结果显示，DM大鼠MMP-9在肾组织中表达明显下调， TIMP-1表达上调，与Mc Lennan等〔7〕研究结果一致。机制可能是肾组织中MMP-9的表达在模型组明显下调，而TIMP-1的表达在DM模型组明显上调，形成病理状态下新的平衡，这种新的平衡状态导致MMP-9对ECM的降解减少，促使ECM在DM大鼠肾小球内的积聚，从而导致肾小球硬化，促使DN的发生和发展。解聚复肾宁可能是通过下调TIMP-1表达及上调MMP-9表达，促进肾小球细胞外基质的降解，从而达到延缓肾小球硬化的作用，其治疗作用机制有待进一步研究。

4 参考文献

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4Sang YH，Jee YH，Han KH，etal.An imbalance between matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 contributes to the development of early diabetic nephropathy〔J〕.Nephrol Dial Thransplant，2006；21(9)：2406-16.

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10Karamessinis PM，Tzinia AK，Kitsiou PV，etal.Proximal tubular epithelial cell integrins respond to high glucose by altered cell matrix interactions and differentially regulate matrixin expression〔J〕.Lab Invest，2002；82(8)：1081-93.

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