独活香豆素对帕金森病模型大鼠抗氧化功能及谷氨酸含量的影响

裴 媛 马贤德 易 杰 李 姗 王思懿 马 进

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110000)

帕金森病(PD)是中老年人常见的神经系统变性疾病，目前西医以左旋多巴为最有效的治疗药物，但其仅能改善症状，且长期应用有严重的副作用。中医治疗以平肝补肾、益气活血中药居多〔1〕。本文拟观察独活香豆素对蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导的PD模型大鼠抗氧化功能及兴奋性氨基酸谷氨酸(Glu)含量的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SD成年大鼠72只，购于中国医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(辽)2008-0005，雌35只，雄37只，体重：280～300 g。饲养温度22℃～25℃，自然光线，自由饮食。正常饲养1 w后，进行模型制备。饲料为辽宁中医药大学实验动物中心提供的标准颗粒饲料。

1.1.2试剂及药品 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、Glu试剂盒由南京建成生物工程研究所生产，批号：201109；Lactacystin由美国sigma公司生产，货号：L6785；独活香豆素：中药饮片独活一次性购于辽宁中医药大学附属医院药局，后经沈阳药科大学采用超临界CO2萃取方法提取独活香豆素；美多巴：上海罗氏制药有限公司生产，批号SH1186；布洛芬：中美史克制药有限公司生产，批号 11030064。

1.1.3主要仪器设备 紫外分光光度计：T6新世纪型，北京普析通用仪器设备有限公司生产；离心机：C4-12型，法国JOUAN捷安集团(公司)生产。

1.2方法

1.2.1PD大鼠模型制备 72只大鼠按性别、体重随机取11只(6雄，5雌)分为正常对照组，其余61只为PD模型复制组。参照文献〔2〕，采用Lactacystin脑定位注射法制备模型。10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，大鼠固定在立体定向仪上，齿杆较耳杆低2.4 mm，根据《大鼠脑立体定向图谱》〔3〕，确定造模给药部位为左侧黑质致密部，即前囟后5.2 mm、矢状缝左侧2.2 mm、硬膜下7.2 mm。切开颅部皮肤，钻开颅骨(勿伤及硬脑膜)，定向注射Lactacystin 10 μg(2 μl生理盐水溶解)，缓慢进针，注射速度为0.5 μl/min，留针5 min，缓慢退针，缝合切口。正常对照组同部位注射等体积生理盐水。

1.2.2药物干预前大鼠行为观察 观察大鼠造模后第7、14、21天的行为改变：是否出现震颤、运动迟缓、活动减少等行为异常。在造模后第21天，大鼠出现了明显的运动迟缓和活动减少，部分大鼠出现震颤；随机取模型复制组、正常对照组大鼠各(雄性)1只，进行左侧脑黑质病理切片观察，发现模型复制组大鼠脑黑质神经细胞数量减少，路易小体形成，见图1，说明模型复制成功。

PD模型组

正常对照组

1.2.3分组与药物干预 从造模后的第22天起，将60只模型复制组大鼠按性别、体重随机均分为6组，分别为：模型组、独活香豆素低剂量(正常量)组、独活香豆素中剂量(3倍量)组、独活香豆素高剂量(9倍量)组、美多巴组、布洛芬组。除模型组外，其余5组分别予以药物干预，独活香豆素低剂量组：独活香豆素22.05 mg·kg-1·d-1，相当于独活生药(饮片)1.04 g·kg-1·d-1；独活香豆素中剂量(3倍量)组：独活香豆素66.15 mg·kg-1·d-1；独活香豆素高剂量(9倍量)组：独活香豆素198.45 mg·kg-1·d-1；美多巴组：美多巴26.05 mg·kg-1·d-1；布洛芬组：布洛芬62.5 mg·kg-1·d-1。模型组和正常对照组均为生理盐水5 ml·kg-1·d-1。以上7组大鼠给药途径均为灌胃(体积相同)，干预21 d。

1.2.4药物干预后大鼠行为学观察与测定 观察各组大鼠在药物干预(灌胃)后第7、14、21天行为变化，重点观察大鼠有无震颤、运动迟缓、活动减少等行为异常。

药物干预后的第21天(造模后第42天)进行开野实验测定。开野实验箱：黑色敞口木箱，大小为60 cm×60 cm×40 cm，箱底划分为25个方格(12 cm×12 cm /格)。将各组大鼠分别放入正中一格，10 s后开始记录15 s内大鼠下肢站立次数、嗅箱壁(鼻子距离箱壁5 cm以内)次数、穿梭距离等指标。开野实验检测期间实验室内暗光、安静。

1.3指标测定 给药后第21天，停药，禁食24 h，称重。10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉。经腹主动脉取血2 ml，检测血清T-SOD活性、MDA、Glu含量；同时在冰台上，迅速取脑组织，检测脑组织中MDA、Glu含量。MDA含量用硫代巴比妥酸法测定，Glu含量用比色法测定，血清T-SOD活性用黄嘌呤氧化酶法测定，具体步骤均按试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1独活香豆素对PD大鼠行为变化的影响 与正常对照组比较，模型组、独活香豆素高、中、低三个剂量组、美多巴组、布洛芬组大鼠下肢站立次数、嗅箱壁次数、穿梭距离均明显减少(P<0.01 或P<0.05)；与模型组相比，独活香豆素高、中、低三个剂量组、美多巴组、布洛芬组大鼠下肢站立次数、嗅箱壁次数、穿梭距离均明显增多(P<0.01)。见表1。独活香豆素高、中剂量组和美多巴组优于独活香豆素低剂量组和布洛芬组(P<0.01或P<0.05)，独活香豆素高、中剂量组、美多巴组之间无差异(P>0.05)。

2.2独活香豆素对PD大鼠血清、脑组织MDA、Glu含量的影响 与正常对照组比较，模型组、独活香豆素高、中、低三个剂量组、美多巴组、布洛芬组大鼠血清和脑组织MDA、Glu含量均明显增多(P<0.01)；与模型对照组相比，独活香豆素高、中、低三个剂量组、美多巴组、布洛芬组大鼠血清和脑组织MDA、Glu含量均明显减少(P<0.01)。见表2、表3。独活香豆素高、中剂量组和布洛芬组大鼠血清、脑组织MDA、Glu含量低于独活香豆素低剂量组和美多巴组(P<0.01)，独活香豆素高、中剂量组、布洛芬组间无差异(P>0.05)。

2.3独活香豆素对PD大鼠血清T-SOD活性的影响 与正常对照组比较，模型组、独活香豆素高、中、低剂量组、美多巴组、布洛芬组血清T-SOD活性均明显降低(P<0.01)；与模型组相比，独活香豆素高、中、低三个剂量组、美多巴组、布洛芬组血清T-SOD活性均明显增高(P<0.01)。见表2。独活香豆素高、中剂量组和布洛芬组血清T-SOD活性高于独活香豆素低剂量组和美多巴组(P<0.01)，独活香豆素高、中剂量组、布洛芬组间无差异(P>0.05)。

表1 各组开野实验结果比较

表2 各组大鼠血清中T-SOD活性、MDA、Glu含量比较

表3 各组大鼠脑组织中MDA、Glu含量比较

3 讨 论

目前PD发病机制尚不十分清楚，一般认为与遗传因素和环境因素密切相关，氧化应激、抗氧化机制障碍、兴奋性氨基酸毒性作用是其重要的发病机制之一。PD的治疗药物左旋多巴(L-Dopa)是金标准，可减轻症状，但不能减慢疾病的进程，且长期使用会出现开关现象、运动障碍或精神改变等严重副作用。复方L-Dopa，如美多巴，是左旋多巴和苄丝肼1∶4 的混合制剂，但这类药物长期服用也可产生类似左旋多巴的不良反应。布洛芬等非甾体类药物虽对PD有保护作用，但因其肠胃部不适或皮疹、头痛、耳鸣等副作用，也非PD常规用药。

SOD作为抗氧化酶，能清除超氧阴离子和自由基，是保护细胞免受氧化损伤的第一道防线，其活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。机体产生的氧自由基能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化物，如MDA、羟基、羰基等，从而引起细胞死亡。MDA作为体内脂质过氧化的标志物之一，可间接反映细胞受自由基攻击的严重程度。有研究发现，在PD患者死后脑黑质中，MDA及过氧化氢(H2O2)等脂质过氧化物明显增加〔4〕。针灸可使PD大鼠脑黑质中降低的 SOD、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)上升至正常水平〔5〕。

兴奋性氨基酸(EAA)是广泛存在于哺乳类动物中枢神经系统的正常兴奋性神经递质，参与突触兴奋传递、学习记忆形成及多种神经变性疾病的发生。EAA包括L-Glu和L-天门冬氨酸(Asp)，Glu 含量最高。一些研究表明：(1)兴奋性氨基酸(主要是Glu)的神经毒作用可选择性引起黑质DA 能神经元变性〔6〕。EAA 作为神经递质具有Ca2+依赖的释放形式，Glu 的神经毒作用主要由Ca2+介导，当Glu 浓度增高时，形成对其受体，即N-甲基-D-天冬氨酸型(NMDA)受体的爆发性占领，NMDA 受体过度激活，会导致大量Na+、Ca2+持续内流，细胞内Ca2+超载，线粒体呼吸链功能受损；同时，Glu 还可通过激活NMDA 受体产生一氧化氮(NO)，后者对神经细胞有直接杀伤作用，从而导致DA能神经元的迟发性变性和坏死。(2)PD运动症状的出现是由于纹状体DA能神经元缺失，来自大脑皮质的Glu能神经元兴奋性增强，致使纹状体投射到苍白球的兴奋过度加强而产生〔7〕。(3)PD时黑质神经元存在线粒体功能障碍、能量代谢降低，DA能神经元对Glu的敏感性增强〔8〕。(4)伦学庆等〔9〕认为Glu参与了PD的发病过程，减少或阻断兴奋性氨基酸的释放将有助于PD的治疗。

关于PD动物模型研究很多，蛋白酶抑制剂Lactacystin诱导的PD模型是目前公认的、比较新的和理想的动物模型〔2，10〕，它既能模拟出PD的慢性过程、行为学改变，又能模拟出黑质部位神经元变性、数量减少、Lewy小体形成等典型的病理特征，且效果稳定，优于其他PD动物模型。

独活是祛风湿散寒类中药，被列为该类中药之首。独活始载于《神农本草经》，被列为上品。独活主要用于治疗风寒湿痹痛及外感风寒挟湿表证，对腰膝、腿足关节疼痛属下部寒湿重者及肾气虚弱，当风受冷所致偏枯冷痹缓弱疼痛等效果尤佳。但纵观历代医家对中药独活的记载，可以发现独活还具有调补五脏、尤补肝肾、祛瘀化痰、宣通脑络之功，是一味入阴而升阳、通补并用的良药。

现代药理研究发现，从独活中可分离出29种香豆素类成分，它们具有抑制血小板聚集和血栓形成、抗心律失常、扩冠、降压、钙拮抗、抗炎、免疫调节、镇痛、镇静、催眠、抗肿瘤、解痉、抗胃溃疡等作用。我们前期研究已表明，独活水煎剂、颗粒剂及醇提物对脑老化、阿尔茨海默病(AD)模型鼠具有延缓衰老的作用，并参与了多种抗衰老机制的调节〔11〕。

本研究结果提示：(1)应用蛋白酶抑制剂Lactacystin脑内定位注射制备的PD模型大鼠存在行为学异常、氧化应激反应及兴奋性氨基酸GLu异常增多等改变。(2)独活香豆素能够改善PD模型大鼠行为学异常、氧化应激及兴奋性氨基酸GLu的异常增多；在独活香豆素三个剂量组中，以独活香豆素中剂量组效量比高。(3)独活香豆素对PD模型大鼠行为学异常的改善，可能与其减少氧化应激、增强抗氧化能力、减少兴奋性氨基酸Glu的异常增多有关。

4 参考文献

1梅加明，牛朝诗，陈建民，等.蛋白酶体抑制剂诱导帕金森病大鼠模型行为学退行性 中国微侵袭神经外科杂志，2008；13(10)：466-9.

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8McNaught KS，Bjoklund LM，Belizaire R，etal.Proteasome inhibition causes nigral degeneration with inclusion bodies in rats〔J〕.Neuroreport，2002;13(11)：1437-41.

9裴 媛，李德新，孙松辉.独活及其醇提物对自然衰老小鼠脑组织细胞凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志,2005；25(8)：959.

10李海权，李德新，孙松辉.衰老小鼠脑组织mtDNA缺失呼吸链酶复合体活性的变化以及独活作用机制的实验研究〔J〕.中医药学刊,2006；24(2)：241-3.

11金红姝，李德新，孙松辉.独活及其醇提物延缓脑老化机制的实验研究〔J〕.上海中医药杂志，2003；37(11)：54-6.