着丝粒蛋白-F在乳腺癌中的表达及其与预后的相关性

闻淑娟 安 欣 杨 航 彭柔君 史艳侠

(中山大学肿瘤防治中心肿瘤内科，广东 广州 510060)

乳腺癌的发生是多因素、多阶段、进行性发展的过程，涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的失活。着丝粒是与细胞周期以及细胞增殖检查点调控相关的重要结构，组成着丝粒的着丝粒蛋白(CENPs) 是发挥作用的主要元素。CENP-F是人类CENPs中分子量最大的一个成员，在细胞有丝分裂中发挥着重要作用〔1〕。目前国内尚无CENP-F在乳腺癌中的表达及与乳腺癌预后关系的相关研究。本文拟分析CENP-F蛋白在乳腺癌标本中的表达，探讨它们与乳腺癌发生发展的关系及预后评估的意义。

1 材料与方法

1.1对象 选取2000年1月至2002年12月在中山大学肿瘤防治中心行乳腺癌改良根治术或根治术的原发性乳腺癌患者158例，全部为女性，术前未行化疗、放疗和内分泌治疗。另选20例正常乳腺组织作为对照组。年龄22～73岁(中位年龄45岁)。所有患者均为浸润性导管癌(2003年WHO肿瘤分类标准)，ECOG评分≤1；全部乳腺癌病例随访73.4 个月(13.3～160个月)。所有患者均有完整的临床资料。

1.2方法

1.2.1免疫组化方法 按照试剂盒说明书二步法步骤执行 (Dako Carpinteria，CA)。用已知阳性片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为空白对照。将石蜡包埋的标本按4 μm切片，常规脱蜡后抗原修复，然后置入3%H2O2室温孵育15 min后滴加一抗，置于湿盒中4℃过夜；PBS冲洗后滴加辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，室温孵育30 min；PBS冲洗后DAB显色，洗涤，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片，镜下观察。

1.2.2结果判断 免疫组化染色结果由两位病理科医师独立阅片得出。CENP-F染色评分采用染色强度及染色程度两方面评估。出现棕黄色或棕色颗粒的细胞为阳性细胞，CENP-F阳性部位在细胞核。染色强度得分0～3分，0分(无染色)，1分(淡黄色颗粒)，2分(棕黄色颗粒)和3分(棕色颗粒)。染色程度得分0分(0%)，1分(1%～10%)，2分(11%～ 25%)，3分(26%～50%)及4分(>50%)，强度和程度得分之和作为最后CENP-F染色评分(0～7)，最终染色分数<3分为CENP-F阴性表达，≥3分为CENP-F阳性表达。

1.2.3随访及评价标准 随访从治疗第一天开始计算，所有患者均随访至2013年6月。总生存时间 (OS)指从诊断之日起至死亡时间。随访终止未死亡病例按删失病例处理。

1.3统计学分析 应用SPSS18.0软件，各组间率的比较采用χ2检验；相关分析采用Spearman等级相关；应用Kaplan-Meier法制作生存曲线，使用Log-Rank检验比较生存差异，分析研究OS的线性趋势。应用Cox比例风险回归模型行多因素分析。

2 结 果

2.1CENP-F在乳腺癌中的表达 158例乳腺癌组织中，89例阴性表达，69例(43.7%)CENP-F阳性表达，正常乳腺细胞未见CENP-F表达或仅见低表达。见图1。

图1 CENP-F在乳腺癌细胞中的过表达(DAB)

2.2CENP-F表达与乳腺癌临床病理因素的关系 CENP-F 表达与淋巴结转移(P=0.033)及临床分期(P=0.027)有关。与年龄、肿块大小、激素受体(HR)、人表皮生长因子受体(Her-2)及Ki67表达等因素无关(P>0.05)，见表1。

表1 CENP-F的表达与乳腺癌组织临床病理特点的关系〔n(%)〕

2.3CENP-F阳性表达与患者OS呈负相关 CENP-F阴性表达组患者5年生存率为96.6% (86/89) ，CENP-F阳性表达组患者5年生存率为88.4% (61/69) 。CENP-F阴性组10年总生存率(57.3%)明显高于阳性组(24.6%)(P<0.001)。 CENP-F的表达与OS有关，CENP-F阴性表达患者的OS明显高于阳性患者〔(130.00±4.15)vs(103.00±9.09)个月，P=0.004〕(图2)。应用Cox模型对生存资料行多因素分析，把年龄、肿块大小、有无淋巴结转移、TNM分期、CENP-F、HR、HER-2和Ki67表达纳入乳腺癌OS的全变量模型分析，结果显示CENP-F阳性表达(P=0.039)、淋巴结转移(P=0.045)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(P=0.002)、HER-2过表达(P=0.031)及Ki67≥15%(P=0.021)均为影响乳腺癌OS的独立不良预后因素。而HR的表达则为乳腺癌OS的有利因素(P=0.015)(见表2)。

图2 CENP-F阳性表达与OS的相关性分析

表2 乳腺癌OS的预后分析

3 讨 论

在细胞有丝分裂和减数分裂过程中，着丝粒是保证染色体稳定存在，并且正常分裂、分离到子细胞中的基本结构、功能元件之一。CENP-F 又称Mitosin/P330d，本质是一种核磷蛋白，全长10.3 kb，编码3 210个氨基酸，分子量367 kD〔2，3〕。着丝粒位于染色体表面，其上可附着纺锤体微管。CENP-F在有丝分裂中起重要作用，包括着丝粒和着丝点成熟、染色体调整和分离、分裂后期纺锤体的稳定等〔4〕。因此，细胞周期特异性表达的CENP-F可以作为增殖的潜在标记物。目前国外有文献报道40%左右的乳腺癌患者中有CENP-F的扩增和过表达，CENP-F过表达与肿瘤大小、组织学分级相关，提示该癌基因与乳腺癌进展有关，可能参与细胞的分化调节〔5〕。本实验结果也提示CENP-F阳性表达与病期进展相关。事实上，CENP-F已被证实在多种肿瘤中均有扩增，且CENP-F的过表达与肿瘤的增殖有密切关系，如非霍奇金淋巴瘤、胃肠间质瘤、鼻咽癌等〔6～8〕。CENP-F能够促进肿瘤增殖可能与CENP-F的功能有关。CENP-F法尼基化后，在有丝分裂期与其他蛋白参与着丝粒装配、微管附着、纺锤体检测〔9〕。CENP-F异常表达使着丝点聚集和纺锤体检查点功能紊乱，从而促进染色体不正确分离，造成正常遗传物质丢失，导致遗传物质的丢失，增加肿瘤的增殖活性〔10〕。

本研究显示CENP-F阳性表达的乳腺癌患者预后差，生存期短。CENP-F阳性表达是肿瘤不良预后因素的结论在其他肿瘤中也有报道。Cao等〔8〕在鼻咽癌的研究结果显示，CENP-F过度表达的鼻咽癌肿瘤恶性程度增强，复发和转移发生早，预后差，并与患者的无病生存和总生存期有关〔7〕。Guardia等〔11〕报道CENP-F高表达的头颈部鳞状细胞癌总生存期明显低于阴性表达组，且CENP-F高表达是头颈部鳞状细胞癌OS的不良预后因素之一〔11〕。吴长山等〔12〕研究结果显示CENP-F阳性表达的脑膜瘤患者具有较高的肿瘤复发率和较短的无瘤生存时间。CENP-F表达与染色体不稳定(CIN)有关，后者在大部分肿瘤分级和预后中起着决定性作用〔13〕，这可能是CENP-F阳性表达是肿瘤不良预后因素的机制。但是，CENP-F的生物学功能与CIN之间的具体机制尚未阐明，今后仍需进一步的深入研究。

综上所述，CENP-F在乳腺癌中呈扩增和过表达，CENP-F过表达与乳腺癌的发生发展密切相关，CENP-F高表达是乳腺癌的不良预后因素，可作为指导治疗和估计预后的参考指标，CENP-F检测可为临床确诊及预后判断等提供重要依据。

4 参考文献

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8Cao JY，Liu L，Chen SP，etal.Prognostic significance and therapeutic implications of centromere protein F expression in human nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Mol Cancer,2010;9：237.

9Feng J，Huang H，Yen TJ.CENP-F is a novel microtubule-binding protein that is essential for kinetochore attachments and affects the duration of the mitotic checkpoint delay〔J〕.Chromosoma, 2006；115(4)：320-9.

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11de la Guardia C，Casiano CA，Trinidad-Pinedo J，etal.CENP-F gene amplification and overexpression in head and neck squamous cell carcinomas〔J〕.Head Neck, 2001；23(2)：104-12.

12吴长山，肖 瑾，万经海，等.人脑胶质瘤中CENP-F表达与VEGF及血管增生相关性〔J〕.安徽医科大学学报,2007;42(6):634-7.

13Kronenwett U，Huwendiek S，Ostring C，etal.Improved grading of breast adenocarcinomas based on genomic instability〔J〕.Cancer Res, 2004;64(3)：904-9.