痛泻要方对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织中NF-κB p65基因和蛋白表达的影响

朱向东 曹燕飞 王 燕 段永强

(甘肃中医学院基础课部，甘肃 兰州 730000)

溃疡性结肠炎(UC)是以腹痛腹泻、黏液脓血便持续或反复发作为主要症状的肠道慢性非特异性炎症。该病发病原因及机制尚不明确，复发率高，且有癌变倾向，目前尚缺乏满意的治疗方法，已被列为现代难治病之一〔1，2〕，因此，有关其病因病机的探讨以及治疗药物的研发已成为近年来的研究热点。笔者临床上用痛泻要方加减治疗该病，取得了显著疗效。前期药效学研究证实痛泻要方能有效改善UC黏膜炎症、促进溃疡的修复，但作用机制不清。NF-κB是一种多功能核转录因子，具有广泛的生物学活性，在机体免疫炎症反应中起重要作用。已有动物实验证实〔1〕，NF-κB p65的表达与UC的发病密切相关，但目前对于NF-κB p65与UC的关系研究还不够深入，NF-κB p65在肠道炎症中的作用机制还不十分清楚。本实验在前期研究的基础上进一步探讨痛泻要方对UC大鼠模型结肠黏膜NF-κB p65蛋白和基因表达的影响，以期探讨痛泻要方的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 采用SPF级Wistar大鼠60只，体质量(180±10)g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，SPF级动物质量合格证号：SCXKC(甘)2004-0006；SPF级实验设施合格证号：SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.1.2试剂 2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：购于北京邦定泰克生物技术有限公司，由美国sigma公司生产，批号为〔2008-16-2〕； TRIzol试剂(批号19919)、琼脂糖(批号0000101394)均购自Invitrogen公司；反转录试剂盒(批号0000007526)、PCR试剂盒(批号108030404)均购自Promega Corporation。一抗NF-κB p65 (北京博奥森生物工程开发有限公司)；SP免疫组化染色试剂盒(北京博奥森生物工程开发有限公司)；DAB染色试剂盒(北京博奥森生物工程开发有限公司)。

1.1.3仪器与设备 美国BIO-RAD S1000TM型PCR仪；美国BIO-RAD 凝胶成像仪、电泳槽、电泳仪等；美国Bio-RAd核酸定量分析仪；德国3-16PK型通用台式高速离心机、海尔DM-86L626型立式超低温冰箱等；成都太盟BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统。

1.1.4受试药物 痛泻要方由4味药物组成。按原方3∶2∶1∶1的比例取陈皮、白术、白芍、防风，用8倍量70%的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3次醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，干燥得干膏，干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，冰箱保存备用。柳氮磺胺嘧啶(SASP):上海信谊嘉华药业有限公司，批号：H31020557。

1.2方法

1.2.1造模方法 采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型：将Wistar大鼠60只，禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性将TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门约7～8 cm深的肠腔内，留置数分钟。然后用针头抽取一定量的空气，同样的方法注入大鼠肠腔，防止溶液外漏，让动物保持平躺状态，自然清醒；空白组10只大鼠也采用同样方法用等量的生理盐水灌肠。

1.2.2分组与给药 将实验动物分为6组：空白组、模型组和痛泻要方低、中、高剂量组及SASP组，每组10只。除空白组外均以100 g/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合试剂灌肠。痛泻要方低、中、高剂量组分别按生药11、22、44 g/kg剂量灌胃(按照临床成人用量的5、10、20倍折算)，SASP组按0.3 g/kg剂量灌胃，灌胃体积均为10 ml/kg，空白组、模型组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第2天开始灌胃，1次/d，连续21 d。3 w后处死，取标本。

1.2.3取材 大鼠禁食24 h(不禁水)后，脱颈椎法处死大鼠，取血后迅速剖腹，取出距肛门以上8 cm处结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷PBS缓冲液冲洗肠内容物，肉眼观察各组大鼠肠组织大体形态情况记录并进行评分。取病变最明显处0.5 cm左右结肠组织，迅速移至液氮中保存，用于基因表达检测。大体形态损伤评分参照Luketal标准进行：0分：无损伤；1分：充血但没有溃疡；2分：充血而且肠壁变厚但没有溃疡；3分：有1处小溃疡，直径约0～1 cm；4分：溃疡较大，直径约1～2 cm，但肠管与外周脏器无粘连；5分：溃疡直径1～2 cm，肠管增厚，与周围脏器粘连严重。

1.2.4免疫组织化学法检测PPAR-γ蛋白表达 采取经典的 SABC法，将固定好的石蜡切片常规脱蜡至水。每张切片滴加3% H2O2，室温放置10 min。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中进行抗原热修复，自然冷却至室温，滴加5%BSA封闭液，室温20 min。分别滴加NF-κBp 65一抗，4℃冰箱过夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37℃培养箱中孵育20 min。滴加试剂SABC，在37℃培养箱中孵育20 min。DAB显色剂，苏木素轻度复染3 min；经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在显微镜下观察结果，拍片。染色对照：同一组片中，用PBS代替一抗作孵育，其余步骤同上。

NF-κB p65蛋白表达结果判定及测量方法：NF-κBp65蛋白主要表达于大鼠结肠组织中的肠道黏膜及黏膜下层，以胞质为主。NF-κB p65表达阳性为胞质呈黄绿颗粒染色，颜色越深，表达越强；未出现黄绿颗粒为阴性。采用BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统，随机选取5个视野，测量阳性细胞平均灰度值。灰度值大，蛋白表达多，反之则表达少。

1.2.5RT-PCR法检测NF-κB p65 mRNA的表达 总RNA的提取采用经典的Trizol法，应用Bio-RAd核酸定量分析仪测定总RNA的浓度和纯度，确保2.0>A260 nm/A280 nm>1.8。参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，合成cDNA。用cDNA模板对大鼠内参照β-actin及NF-κB p65基因分别进行PCR扩增。引物由金唯智生物科技北京有限公司合成，内参照β-actin引物序列为:上游引物:5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3′，扩增产物长度292 bp；NF-κB p65引物序列为:上游引物：5′- GAGCAAGCCATTAGCCAGCG -3′，下游引物：5′- CACGGTTATCAAAAATCGGA -3′，产物长度173 bp。扩增反应体系为50 μl，其中cDNA 5 μl；上下游引物各1 μl；MgCl23 μl；10×Reaction Buffer 5 μl；dNTP Mix 1 μl；Tap DNA聚合酶 0.25 μl；无酶水补足至50 μl。扩增参数为:预变性95℃ 2 min，95℃变性45 s，退火52℃ 45 s，72℃延伸30 s，共32个循环(β-actin为25个循环)，总延伸72℃ 5 min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪上成像，采用QuantityOne图像分析软件分析数据，获得各电泳条带的积分光密度(X)，用β-actin的积分光密度(A)作为内参照，计算基因的相对表达量(X/A)作为实验数据。

2 结 果

2.1一般状态 模型组大鼠在造模当天开始出现稀便，觅食较不主动，食量减少，肛周污浊；于1 w内体重有所下降，毛色晦暗无光泽且被粪便沾染，持续稀便，部分大鼠有血便且肉眼可见，各治疗组中痛泻要方低、中剂量组症状缓解较慢，毛色仍稍显晦暗无光泽，食量较少，扎堆、稀便及血便症状缓解不明显，不活跃；痛泻要方高剂量组、SASP组随着给药时间的持续，症状明显好转，大部分大鼠稀便症状消失，基本恢复正常，粪便呈灰褐色颗粒状，毛色逐渐转为光亮润泽，食量正常，活跃，体重增长。各治疗组中以痛泻要方高剂量组和SASP组症状改善最为明显。

2.2结肠黏膜损伤情况 模型组大鼠结肠黏膜可见明显的充血、水肿、溃疡，肠壁变厚、肠道缩短。经痛泻要方及SASP治疗后大鼠结肠黏膜损伤情况均明显改善，但各组具体情况不相同，其中痛泻要方高剂量组及SASP组各大鼠黏膜仅有少量的充血水肿，其余损伤恢复正常。痛泻要方高剂量组、SASP组与模型组比较，评分明显降低(P<0.01)。痛泻要方各治疗组随着剂量的增加，评分逐渐降低，痛泻要方高剂量组与SASP组相比较，评分差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3NF-κB p65蛋白表达的检测结果 空白组NF-κBp65蛋白少量表达。模型组表达较多，阳性细胞数量较多；SASP组表达较弱，数量较少。痛泻要方低剂量组表达中等，阳性细胞数量中等。痛泻要方高剂量组和中剂量组NF-κB p65蛋白表达较弱，阳性细胞数量较少，与SASP区别不大。阳性细胞平均光密度值结果见图1，表1。

2.4RT-PCR 半定量结果 空白组大鼠结肠黏膜NF-κB p65的表达(0.58±0.29)处于较低水平，用TNBS/乙醇灌肠造模后NF-κB p65表达量显著升高(P<0.01)，经痛泻要方治疗后与模型组(1.45±0.56)比较，NF-κB p65的表达水平降低(高、中、低剂量组分别为0.80±0.29、0.87±0.21、1.02±0.33)(P<0.05、P<0.01)，SASP组为0.85±0.27，图2。

图1 NF-κB p65蛋白表达(DAB，×40)

表1 痛泻要方对UC大鼠结肠黏膜损伤评分及NF-κB p65蛋白表达水平的影响

Tg：痛泻要方高剂量组；Tz：痛泻要方中剂量组；Td：痛泻要方低剂量组；B：空白组；S：SASP组；Mo：模型组

3 讨 论

UC是一种与免疫直接相关的肠道慢性非特异性炎症性疾病，临床表现以腹泻、黏液脓血便、腹痛、里急后重等症状为主。病变可见溃疡和炎症，主要局限在结肠黏膜及黏膜下层，多累及远端结肠和直肠。本病反复发作、治愈难度大，容易恶化和癌变，给患者带来巨大痛苦。西医治疗UC以氨基水杨酸制剂、糖皮质激素和免疫抑制剂为主，但效果不甚理想且容易复发〔1〕。其病因和发病机制研究多认为与环境、遗传、感染等因素有关。中医药治疗UC有明显优势，在中医辨证论治思想的指导下，其临床疗效显著。很多经典方剂，如乌梅丸、白头翁汤、痛泻要方等经典方剂已被临床研究证明有显著疗效〔2〕。但在实验研究中，研究者多关注结肠炎患者寒热错杂、湿热内蕴的中医病机，而对患者精神情志的紊乱导致病情加重关注较少。笔者在临床和前期实验研究发现，很多UC患者因为病程长、病情重、精神压力大，导致肝气郁结，肝郁脾虚而出现精神心理症状，而采用具有疏肝健脾功效的痛泻要方治疗，能取得显著疗效。

NF-κB是一种具有多向性转录调节作用的核蛋白因子，广泛存在于各种组织中，在炎症反应和免疫、病毒感染、细胞生长等方面发挥重要作用〔3〕。有功能活性的NF-κB二聚体大都含p65亚单位，这样的二聚体具有显著的促炎活性。目前已有研究证实UC中炎症因子分泌的重要调控者之一就是含p65的NF-κB二聚体的激活〔4〕。UC的发病与NF-κB p65的表达密切相关〔5〕，NF-κB p65参与UC发病的可能机制是：当NF-κB p65被活化后，可以直接调节一系列炎症细胞因子、黏附分子等的基因转录以及蛋白质合成，使这些炎症递质释放增加，导致结肠黏膜的病理损伤〔6〕。另外，当脂磷壁酸、肽聚糖、脂多糖等抗原与肠道抗原提呈细胞PPRs(NOD、TLRs等)相结合，一方面NF-κB信号通路被激活〔7，8〕，能自身分泌细胞因子，另一方面则启动肠道获得性免疫，被激活的免疫细胞产生肿瘤坏死因子、白介素、干扰素等炎症因子，而这些炎症因子又可以反作用于NF-κB信号通路，使更多的NF-κB蛋白转移到核内，调控多种炎症因子相关基因的表达，进一步使肠道炎症反应加重，所以如果能阻止NF-κB信号通路的开放，就可能十分有效地治疗肠道炎症〔9～11〕。

本实验结果表明，空白组大鼠结肠黏膜中NF-κB p65蛋白和基因表达较弱。模型组大鼠结肠黏膜中NF-κBp65蛋白和基因表达量升高，说明在UC发病时，NF-κB信号通路可能已被激活。而治疗组NF-κB p65蛋白和基因表达量又明显低于模型组，说明痛泻要方可能具有阻止NF-κB信号通路开放的效用。本实验还证实NF-κB p65蛋白和基因表达量与结肠黏膜组织的损伤程度呈正相关，也支持上述研究结果。上述研究结果表明，NF-κBp65的激活参与了UC的发病。痛泻要方治疗UC的作用机制可能是发挥疏肝健脾的整体调节作用，起到了激活NF-κB p65的效用。其具体作用机制可能是通过降低NF-κB p65mRNA转录水平，调控NF-κB p65蛋白的表达量，发挥抑制NF-κB p65合成的作用，使NF-κB p65在蛋白水平的表达减少，一方面可能通过抑制阻止NF-κB信号通路的开放发挥其在UC中的抗炎作用，也可能是调控NF-κB的活化，抑制多种炎症细胞因子的释放和表达发挥抗炎作用，其相关作用机制有待进一步研究。

4 参考文献

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