SHP-1基因在多发性骨髓瘤中的表达及意义

李 燕 罗建民 袁 军 王素云 李 杰 杨 洁 王瑞仓 郝洪岭 王 超 韩 颖

(河北省人民医院血液科，河北 石家庄 050000)

SHP-1基因是近年来发现的抑癌基因之一，是众多蛋白酪氨酸激酶之一，是细胞信号转导中关键的负调控因子，调节细胞内的磷酸化水平,前期实验〔1〕证实SHP-1基因在急性白血病中发挥抑癌基因的作用。多发性骨髓瘤是常见的恶性血液病，目前有关SHP-1基因与多发性骨髓瘤关系的研究国内尚无详细报道。本研究旨在探讨SHP-1基因在多发性骨髓瘤发病中的作用及对预后的影响。

1 资料与方法

1.1研究对象 2007年3月至2010年3月我院血液内科住院和门诊随访的患者69例，所有患者均符合张之南主编的血液病诊断中多发性骨髓瘤的诊断标准〔2〕，并采用Durie-Salmon(1982年)分期标准。男43例，女26例,发病年龄45～81岁，中位年龄63岁,好发年龄55～70岁,>55岁有58例(84%)。其中初治组69例，其中Ⅰ期35例、Ⅱ期21例、Ⅲ期13例；IgG 32例、IgA 18例、IgD 5例、轻链型11例、不分泌型3例。根据2011年NCCN多发性骨髓瘤治疗指南中的EBMT标准定义的治疗疗效，经过治疗后，其中完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、轻微缓解(MR),共计42例，无治疗反应(NC)25例，死亡2例。

1.2治疗方案 69例患者中,MP治疗组12例,具体为马法兰6 mg/d，第1～7天、泼尼松1～1.5 mg·m-2·d-1第1～7天，4 w为1疗程。M2治疗组15例,具体为卡氮芥125 mg，第1天,环磷酰胺600 mg·m-2·d-1第1天,长春新碱2 mg，第1天，马法兰6 mg/d，第1～7天、泼尼松1 mg/kg，第1～7天，5 w为1疗程。VAD治疗组31例,具体为长春新碱0.5 mg/d，第1～4天、阿霉素10 mg·m-2·d-1，第1～4 天、地塞米松20 mg/d,第1～4天、第9～12天、第17～20天，4 w为1疗程。硼替佐米联合化疗组11例,硼替佐米剂量为1.0～1.3 mg/m2,第1、4、8、11天，3 w为1疗程,与地塞米松或马法兰、泼尼松联合化疗。

1.3分组 将研究对象分为初治组(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)、CR+PR+MR组、NC组、正常对照组。观察各组中SHP-1基因的表达情况，将初治组分别根据SHP-1 mRNA的表达与否分为阳性组与阴性组，观察两者阳性组、阴性组与缓解率的关系。

1.4检测方法

1.4.1材料 Ficoll 淋巴细胞分离液、M-MLV 、Taq DNA 聚合酶、dNTP、随机六聚体引物均购自Promega公司，Trizol 试剂购自Solarbio 公司。引物由北京赛百盛有限公司合成，SHP-1 的扩增片段长度238 bp，上游引物：5′-GCGGCAGTACTATGC-3′,下游引物：5′-CAGTTCCAACACTCGGTT CTCA-3′。GADPH的扩增片段长度358 bp，上游引物：5′-CGGGAAGCTTGTCATCAA TGG-3′下游引物：5′-GGCAGTGATGGCATGGACTG- 3′。

1.4.2RT-PCR方法检测SHP-1基因的表达 病例组及对照组均采集新鲜骨髓液4 ml，以100 U/ml的肝素抗凝。用TRI-REAGENT提取患者和健康对照组总RNA。逆转录反应体系20 μl，包括细胞总RNA 1 μg，在37℃中反应60 min，95℃反应5 min后终止反应。PCR反应体系为25 μl，包括逆cDNA 1 μl，MgCl21.5 mmol/L,200 μl的4种dNTP，0.5 μmol/L的引物，1.5 U的Taq酶。以GADPH作为内参对照。取10 μl扩增产物，1 g/100 ml琼脂糖凝胶电泳(90 V，40 min)，溴乙啶染色，紫外投射仪上观察结果并照相。RT-PCR扩增条件见表1。

表1 RT-PCR扩增条件

1.5统计学方法 采用SPSS11.5软件进行两个独立样本的非参数检验和χ2检验。

2 结 果

2.1SHP-1 mRNA的表达 所有正常人均能检测到SHP-1 mRNA表达，表达水平为3.309±2.610，用同一实验条件检测69例多发性骨髓瘤患者SHP-1 mRNA，初治组阳性率为42 %，表达水平为0.165±0.132，PR+CR+MR组表达阳性率为59.5%,表达水平为0.608±0.253，NC组表达阳性率为16%，表达水平为0.158±0.121，初治、治疗无反应组多发性骨髓瘤患者中SHP-1表达阳性率与表达水平明显低于正常对照组(P<0.01)。缓解后的SHP-1 mRNA的表达升高，但低于正常对照组(P<0.01)。见图1。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期多发性骨髓瘤之间SHP-1 mRNA的表达水平比较无统计学意义(0.169±0.119，0.154±0.124，0.172±0.153,P>0.05)。

1～3：正常对照组；4～6：完全缓解、Ⅰ期与无治疗反应患者组

2.2SHP-1 基因的表达与临床疗效的关系 SHP-1基因与多发性骨髓瘤患者治疗反应有明显的相关性，SHP-1 基因阳性组缓解率(86.2%)明显高于表达阴性组(44.7%)(P<0.01)，其中表达阳性患者中，有治疗反应的25例，总有效率为86.2%，明显高于表达阴性的患者的治疗有效率(P<0.01)。

3 讨 论

SHP-1基因主要表达在造血细胞，被称为造血细胞磷酸酶(HCP)。SHP-1磷酸酶是细胞信号传导中关键的负调控因子，调节细胞内的磷酸化水平，经研究发现各种白血病、恶性淋巴瘤细胞株中SHP-1 mRNA和SHP-1蛋白水平的下降，其原因在于SHP-1启动区的甲基化或SHP-1蛋白合成转录后阻滞。相反，SHP-1蛋白在非淋巴细胞株中可以表现为正常表达或过度表达。SHP-1位于胞质，与细胞激活、增生、分化和转化等有关，SHP-1主要通过影响生长因子受体、细胞因子受体和免疫反应相关受体的活性而发挥作用，从而抑制细胞增殖，与肿瘤的形成及生长呈负相关〔3〕。目前SHP-1在多发性的骨髓瘤的作用机制尚不明确，可能通过影响其他的调控因子发挥作用，故需要下一步实验证实。

目前已分离纯化的蛋白酪氨酸磷酸酶有40多个，构成PTPs家族，SHP-1属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族。人类SHP-1基因定位于12号染色体的p12-p13区,含17个外显子，全长17 kb〔4〕，外显子3、4， 5、6，8、10分别编码N-末端的SH2域，C- 末端的SH2域和催化功能区。SHP-1蛋白为68 kD的非跨膜酪氨酸磷酸酶，含两个SH2结构域，一个催化片段和约100个氨基酸残基的C-末端， SHP-1位于胞质，与细胞激活、增生、分化和转化等有关，SHP-1主要通过影响生长因子受体、细胞因子受体和免疫反应相关受体的活性而发挥作用，从而抑制细胞增殖，与肿瘤的形成及生长呈负相关〔5〕。

总之，SHP-1不仅参与了白血病的发病，而且在多发性骨髓瘤中也发挥了负性调节作用，它的表达降低或缺失影响着多发性骨髓瘤的发生发展，并为多发性骨髓瘤的治疗中提供理论依据及靶向治疗。

4 参考文献

1韩 颖，罗建民，贾晓辉，等.急性白血病患者SHP-1与C-kit基因表达及其临床意义〔J〕.中国实验血液学杂志，2006；14(5)：871.

2张之南，沈 悌.血液病诊断及疗效标准〔M〕.第2版.北京：科学出版社，1998:373-80.

3Hsu HC,Shultz LD,SU X,etal.Mutation of the hematopoietic cell phosphatase (Hcph) gene is associated with resistance to γ-irradiation induced apoptosis in Src homology protein tyrosine phosphatase(SHP)-1-deficient “Motheaten” mutant mice〔J〕.J Immunol,2001；166:772-80.

4Tsui HW,Hasselblatt K,Martin A,etal.Molecular mechanisms underlying SHP-1 gene expression〔J〕.Eur J Biochem,2002；269(12):3057-64.

5Jones PA, Baylin SB.The fundamental role of epigenetic events in cancer〔J〕.Nat Rev Genet，2002；3(6)：415-28.