17-DMAG对人结直肠癌裸鼠移植瘤微血管形成的抑制作用

廖坚松 陈焕忠 茹晃耀 柯尊富

我国结直肠癌的发病率持续上升，病死率较高。到目前为止，结直肠癌的发病机制尚未完全清楚，其治疗效果仍不够理想，肿瘤的复发和转移是治疗难点。既往的研究表明，结直肠癌的生长、转移和复发均依赖于肿瘤新生血管的生成，故抑制肿瘤新生血管的生成可能成为结直肠癌治疗的新方向[1］。内皮细胞生长因子（VEGF）是一种促肿瘤新血管生成的生长因子，其表达水平与肿瘤的恶性程度、转移和微血管密度等呈正相关[2］。热休克蛋白90（HsP90）抑制剂17-二甲基胺乙基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-DMAG）是格尔德霉素的新一代衍生物，与上一代相比，17-DMAG的水溶性和生物利用度明显提高[3］。笔者见有关17-DMAG抗肿瘤活性的研究较少，故观察了17-DMAG对结直肠癌VEGF的表达和肿瘤微血管生长的影响，以探讨其可能的抗肿瘤作用机制。

材料与方法

一、材 料

BALB/C-nu/nu裸鼠（SPF级）购于中山大学附属第一医院动物实验中心，共24只，4～6周龄，体质量24～28 g，分笼饲养（每笼4只）。人结肠癌SW620细胞株由中山大学附属第一医院动物实验中心提供并保存。17-DMAG购于北京启维益成科技公司，溶解后配成2 g/L的储存液，保存于-4℃冰箱。VEGF购于北京博奥森生物技术有限公司。血小板内皮细胞黏附分子（CD31）购于深圳华拓生物有限公司。

二、动物模型的制备

将人结肠癌SW620细胞株复苏、传代后进行常规收集，调整细胞终密度为5×107个/ml。于裸鼠左侧肋腹部皮下接种，注射剂量为每只200μl，含细胞1×107个。术后精心饲养，每日观察1～2次。一般于接种后4 d出现肉眼可见的肿瘤，隔日用游标卡尺测量肿瘤的大小，计算肿瘤体积：体积=0.52×长径×短径2。

三、实验动物分组及取材

待裸鼠皮下肿瘤生长到体积约100 mm3时，随机把裸鼠分为3组，每组8只：①17-DMAG组腹腔注射17-DMAG 25 mg/kg；②5-氟尿嘧啶（5-FU）组腹腔注射5-FU 20 mg/kg（最常用的结直肠癌化学治疗药）；③对照组腹腔注射生理盐水10 ml/kg。3组均每周给药3次，共4周。4周后采用颈椎脱臼法处死小鼠，剥取瘤组织，测量瘤体质量和体积，按以下公式计算抑瘤率：抑瘤率（%）=（对照组平均瘤质量-药物组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100%[3］。

四、检测项目

1.检测肿瘤组织微血管密度 （MVD）和VEGF

将瘤组织浸入10%甲醛固定，用石蜡包埋切片。切片后的一部分标本进行相关抗原免疫组织化学染色检测CD31、VEGF，严格按试剂盒说明进行，各组标本同一批染色，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替Ⅰ抗作阴性对照。

MVD判断标准：按Weidner等[4］推荐的方法，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个微血管计数.但肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。计数方法如下，首先用低倍镜（10×10）扫视整张切片，确定微血管最密集的3个视野，然后在高倍镜（10×40）视野范围内计数所有染色的微血管。取3个视野计数结果的均数为该切片的微血管数[4］。

VEGF判断标准：观察棕黄或棕褐色颗粒的分布情况，细胞内有棕黄或棕褐色颗粒且强度高于背景的着色细胞为阳性细胞，无棕黄或棕褐色颗粒为阴性细胞。根据细胞染色强度分为4级，并分别计分：阴性为细胞无着色（0分），弱阳性为浅黄（1分），中度阳性为棕黄（2分），强阳性为棕褐（3分）。在每张切片上随机选取10个视野（10×10），计数每一强度视野阳性细胞数所占的比率（F），计算每张切片的平均染色强度[5］。

2.蛋白印迹法检测VEGF表达

切片后的另一部分标本保存于-20℃冰箱，用蛋白印迹法检测肿瘤组织中VEGF的表达。按照Kong等[6］推荐的方法，用Image J1.43软件进行分析，每组样本重复3次，取3次均值。

五、统计学处理

使用SPSS17.0统计软件处理数据。正态分布计量资料以¯x±s表示，3组间比较采用方差分析，方差齐则再进一步采用LSD法进行两两分析，方差不齐则采用Tamhane's T2法。两组抑瘤率比较采用t检验。P＜0.05具有统计学意义。

结 果

一、17-DMAG组、5-FU组及对照组移植瘤体质量、体积和抑瘤率比较

17-DMAG组、5-FU组在给药结束后瘤体质量、瘤体积与对照组相比均明显下降（P＜0.05）；17-DMAG组与5-FU组之间瘤体质量、瘤体积、抑瘤率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。方差分析结果显示，3组瘤体质量比较的F=15.73、P=0.001，瘤体积的F=7.85、P=0.002。见表1。

表1 17-DMAG组、5-FU组及对照组移植瘤重量、体积及抑瘤率的比较

表1 17-DMAG组、5-FU组及对照组移植瘤重量、体积及抑瘤率的比较

注：与对照组比较，a为P ＜0.05

组 别 瘤体质量（g）瘤体积（mm3）抑瘤率（%）17-DMAG组（8只）1.15±0.49a 301.12±25.43a 48.43±6.75 5-FU组（8只） 1.22±0.58a 366.74±28.92a 45.29±8.34对照组（8只）2.23±0.66 968.68±118.66 0

二、17-DMAG组、5-FU组及对照组免疫组织化学染色检测MVD、VEGF结果比较

17-DMAG组给药结束后MVD、VEGF均较5-FU组及对照组低（P＜0.05），方差分析结果显示，3组MVD比较的F=10.69、P=0.001，VEGF比较的F=8.17、P=0.002。5-FU组与对照组给药结束后MVD、VEGF比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。免疫组织化学染色见图1、2。

表2 17-DMAG组、5-FU组及对照组MVD、VEGF比较（¯x±s）

图1 17-DMAG组、5-FU组及对照组MVD免疫组织化学染色图

图2 17-DMAG组、5-FU组及对照组VEGF免疫组织化学染色图

三、17-DMAG组、5-FU组及对照组蛋白印迹法检测VEGF结果的比较

方差分析结果显示，3组给药结束后VEGF比较的F=14.52、P=0.001，17-DMAG组VEGF水平明显低于5-FU组及对照组（P＜0.05）。见图3。

图3 17-DMAG组、5-FU组及对照组蛋白印迹法检测VEGF结果

讨 论

肿瘤血管新生是实体瘤生长、浸润和转移非常关键的因素。新生血管除了为实体瘤提供新陈代谢的途径外，还由于其管壁的高通透性，有利于肿瘤细胞的转移[7］。与肿瘤血管新生密切相关的血管生成因子，如VEGF等，其水平升高在一定程度上反映了肿瘤血管的新生[8］。HSP90几乎控制了所有恶性肿瘤细胞表型组成及细胞信号转导通路，因此，HSP90抑制剂可能会影响肿瘤细胞中多条信号转导通路，全面地影响肿瘤的发生、发展、侵袭和转移 等过程[9］。HSP90抑 制 剂17-AAG 和17-DMAG是苯醌类抗生素戈尔德霉素的衍生物。已有多个肿瘤临床实验证明17-AAG具有良好的治疗效果[10］。但笔者见对水溶性和生物利用度更好的17-DMAG研究较少。本研究选择人结肠癌SW620细胞株来构建肿瘤模型，采用新一代HSP90抑制剂17-DMAG对荷瘤裸鼠进行干预治疗，探讨其对结肠癌血管新生的抑制作用。

有研究认为采用免疫组织化学方法检测CD31的表达，敏感性高、特异性较好，是目前测量肿瘤微血管密度最佳的方法之一[11］。本研究发现，17-DMAG组中MVD明显低于5-FU组和对照组，而5-FU组与对照组之间MVD无明显差异。5-FU虽然对肿瘤的质量、体积有一定的改善，但对肿瘤微血管生成抑制作用不明显；而17-DMAG对肿瘤体积、抑瘤率和微血管新生均有明显改善作用，提示17-DMAG对抑制肿瘤的生长、转移和复发有着重要的作用。

VEGF是一种特异性高的血管内皮细胞刺激因子和血管通透剂，可促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建，促使内皮细胞的迁移和血管内物质的渗漏，是肿瘤发生发展的重要标志[12］。因此笔者选择VEGF为观察疗效的主要指标之一，本研究运用蛋白印迹法检测到的结果显示，17-DMAG组肿瘤组织中VEGF表达明显低于5-FU组和对照组。故提示17-DMAG通过抑制结直肠癌细胞内VEGF表达，从而抑制肿瘤微血管生长，而5-FU并不能通过抑制VEGF阻止肿瘤微血管的生成。

综上所述，17-DMAG能够通过抑制肿瘤微血管生成和VEGF表达起抑制肿瘤的作用。但其作用机制可能还远不止这些，需要不断的研究探讨。

[1]Koshiyama A，Ichibangase T，Imai K.Comprehensive fluorogenic derivatization-liquid chromatography/tandem mass spectrometry proteomic analysis of colorectal cancer cell to identify biomarker candidate.Biomed Chromatogr，2013，27：440-450.

[2]Shibuya M.Vascular endothelial growth factor and its receptor system：Physiological functions in angiogenesis and pathological roles in various diseases.J Biochem，2013，153：13-19.

[3]Aregbe AO，Sherer EA，Egorin MJ，et al.Population pharmacokinetic analysis of 17-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin（17-DMAG）in adult patients with solid tumors.Cancer Chemother Pharmacol，2012，70：201-205.

[4]Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis：a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Nail Cancer lnst，1992，84：1875-1887.

[5]Dias FJ，Issa JP，Barbosa AP，et al.Effects of low-level laser irradiation in ultrastructural morphology，and immunoexpression of VEGF and VEGFR-2 of rat masseter muscle.Micron，2012，43：237-244.

[6]Kong YC，Sun B，Zhao KX，et al.Small interference RNA targeting vascular endothelial growth factor gene effectively attenuates retinal neovascularization in mice model.Chin Med J，2013，126：1440-1444.

[7]Chien CC，Kempson IM，Wang CL，et al.Complete microscale profiling of tumor microangiogenesis：a microradiological methodology reveals fundamental aspects of tumor angiogenesis and yields an array of quantitative parameters for its characterization.Biotechnol Adv，2013，31：396-401.

[8]汤颖，叶增纯，李灿明，等.VEGF对小鼠足细胞黏附性的影响及PI3 K/Akt信号通路在其中的作用.新医学，2013，44：671-675.

[9]Franco MC，Ye Y，Refakis CA，et al.Nitration of Hsp90 induces cell death.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110：1102-1111.

[10]Saxena V，Naguib Y，Hussain MD.Folate receptor targeted 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin（17-AAG）loaded polymeric nanoparticles for breast cancer.Colloids Surf B Biointerfaces，2012，94：274-280.

[11]Ishizaka R，Hayashi Y，Iohara K，et al.Stimulation of angiogenesis，neurogenesis and regeneration by side population cells from dental pulp.Biomaterials，2013，34：1888-1897.

[12]Nonaka Y，Yoshida W，Abe K，et al.Affinity Improvement of a VEGF Aptamer by in Silico Maturation for a Sensitive VEGF-Detection System.Anal Chem，2013，85：1132-1137.