特发性弱精子症患者精子中TCTE3的表达*

李玉山，吉晓菲，王全先，杨险峰，潘周辉，胡耀龙

郑州大学第三附属医院人类精子库 郑州 450052

特发性弱精子症患者精子中TCTE3的表达*

李玉山△，吉晓菲，王全先，杨险峰，潘周辉，胡耀龙

郑州大学第三附属医院人类精子库 郑州 450052

△男，1966年1月生，硕士，教授，研究方向：生殖免疫学，E-mail：liyushanrun@126.com

T复合体相关睾丸表达3；特发性弱精子症；轴丝动力蛋白

目的：探讨T复合体相关睾丸表达3(TCTE3)与特发性弱精子症发生的关系。方法采用RT-PCR和Western blot方法检测正常成年男性(正常对照)和特发性弱精子症患者各30例精子标本中TCTE3 mRNA和蛋白的表达。结果TCTE3 mRNA和蛋白在特发性弱精子症组精子中的相对表达量均低于正常对照组(t=3.038和2.460，P=0.005和0.017)。结论TCTE3表达的降低可能在弱精子症的发生中起着重要作用。

研究[1-2]显示，目前全世界已婚夫妇中，不孕不育者约占15%，其中男性不育约占一半。无精子症、弱精子症、少精子症和畸形精子症是影响男性生育的常见原因，约占男性不育因素的90%[3],其中弱精子症约占19%。为了明确特发性弱精子症发病的相关因素，作者所在的课题组[4-6]前期进行了一系列弱精子症发病关系的相关研究。近年研究发现的T复合体相关睾丸表达3(T-complex associated testis expressed 3，TCTE3)是精子鞭毛和纤毛中段轴丝动力蛋白轻链家族成员之一，编码假定的动力蛋白轻链，表达于小鼠精子鞭毛中段轴丝外侧双联微管。有学者[7]通过基因敲除技术发现TCTE3-/-雄性小鼠出现精子脆弱和前向运动能力降低并且运动不协调，由此推断TCTE3表达缺失会导致雄性小鼠精子鞭毛能动性降低和弱精子症的发生。目前国内外尚缺少TCTE3在人类精子中表达的研究。作者采用RT-PCR和 Western blot方法检测 TCTE3 mRNA和蛋白在正常男性和特发性弱精子症患者精子中的表达情况，进一步为弱精子症的发生及诊断研究提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器RNA提取试剂盒(北京康为世纪公司产品)，反转录试剂盒(美国Thermo公司产品)，PCR试剂盒(上海莱枫公司产品)，TCTE3引物(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)，细胞裂解液RIPA(碧云天生物技术研究所)，鼠抗人TCTE3抗体(台湾Abnova公司)，兔抗鼠IgG(北京博奥森生物公司)；图像扫描仪等为General Electronic公司产品。

1.2标本的筛选收集2012年7月至11月河南省人类精子库合格供精志愿者和郑州大学第三附属医院生殖中心不育门诊弱精子症患者的精液。严格按照WHO第5版的方法进行常规检测，筛选精液量、液化时间、pH、精子形态、精浆果糖、酸性磷酸酶、α葡萄糖苷酶等参数均正常的标本。正常对照组30例，年龄22～35(27.0±2.4)岁，精子密度≥20×106mL-1，精子前向运动能力(PR)≥32%；特发性弱精子症组30例，年龄21～38(30.4±3.0)岁，精子密度≥20×106mL-1，PR<32%。2组血清生殖激素检查均正常，无支原体、衣原体感染，精浆抗精子抗体阴性。

1.3精液的处理待精液液化后，分别经体积分数40%和80%的Percoll液非连续密度梯度离心(2 000 r/min，20 min)，弃去上层液体，收集底部精子，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗涤3次，调精子密度为50×106mL-1，-80 ℃储存备用。

1.4精子中TCTE3mRNA的RT-PCR检测取分离纯化的精子，按照RNA提取试剂盒操作说明书提取RNA，于-70 ℃保存备用。每样本均取等量总RNA 11 μL进行反转录，按试剂盒操作说明合成cDNA。取cDNA 2 μL作为模板，在25 μL体系中进行PCR反应，以β-actin为内参。用Premier 5.0软件设计TCTE3引物序列,上游:5’-TCTGGGACATTG CATGGGAC-3’，下游:5’-AAGGGCAAACACCAAGAC CA-3’，产物大小为83 bp；β-actin引物序列，上游：5’-GAAGGTTATGCCCTGCCTCA-3’,下游:5’-ACATCTCGCACAATCTCCCG-3’,产物大小为137 bp。PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳20 min后，经图像扫描仪拍照扫描，最后用Image J软件对图像进行分析，以TCTE3与β-actin条带灰度值的比值作为TCTE3 mRNA的相对表达量。

1.5精子中TCTE3蛋白的Westernblot检测将1 mL细胞裂解液RIPA与纯化精子相混合，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF(100 g/L)10 μL，混匀后冰上超声裂解(功率200 W)5 s×5次,放置30 min，然后4 ℃ 12 000g离心15 min，BCA法检测上清中总蛋白浓度。将蛋白样品用100 g/L SDS-PAGE凝胶电泳分离后，用20 V电压将凝胶上蛋白半干法转至硝酸纤维素膜上30 min，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，洗涤后与 1800稀释的鼠抗人TCTE3抗体37 ℃孵育1 h，洗涤后再与12 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG室温孵育1 h，经TBST洗涤10 min×3次,进行ECL化学发光处理。以β-actin作为内参。然后用图像扫描仪扫描， Image J软件对图像进行分析，以TCTE3与β-actin条带灰度值的比值作为TCTE3蛋白的相对表达量。

1.6统计学处理应用SPSS 17.0分析。2组精子中TCTE3 mRNA和蛋白表达的比较采用两独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组精子中TCTE3mRNA的表达见图1、表1。

2.2 2组精子中TCTE3蛋白的表达见图2、表1。

M：Marker；N1，N2，N3：正常对照组； A1，A2，A3：特发性弱精子症组。

图2 2组精子中TCTE3蛋白的表达

M:Marker;N1，N2：正常对照组；A1，A2，A3：特发性弱精子症组。

表1 2组精子中TCTE3表达的比较

3 讨论

不孕症的诊断和治疗已经在临床上广泛开展，对弱精子症的探讨成为人们近来感兴趣的课题。特发性弱精子症是男性不育的重要原因之一，它显著的伴随特征为精子运动能力下降。精子运动缺陷的潜在分子机制在很大程度上仍不为人知。根据精子超微结构，精子鞭毛的异常在一定程度上会影响精子的活动和功能，包括线粒体异常、外周致密纤维异常、轴丝畸形等，尤其是轴丝中周围微管支臂的异常。微管的动力蛋白臂结构、排列方式、表达量等是精子正常运动的基本保证。蛋白质组学研究发现了200多种鞭毛蛋白，其突变可能会导致一些疾病的发生。TCTE3基因编码精子鞭毛和纤毛中段轴丝动力蛋白轻链，TCTE3蛋白与其他动力蛋白轻链有高度的相似性[8]。研究[9]结果表明，TCTE3首先在小鼠的睾丸中鉴定，细胞化学检测发现其定位于精子鞭毛整个长度，常作为非孟德尔遗传定律研究的候选基因，也是引发细胞程序性死亡的重要基因。

TCTE3，又称tctex2，是tctex家族成员之一(该家族包括tctex、tctex1、tctex1L、tctex2、tctex2beta和tctex5)，编码由198个氨基酸组成的相对分子质量为23 000的蛋白质，它含有4个内含子,并与其他哺乳动物编码的蛋白有87%的同源性[10]。 研究[11]表明TCTE3分布于精子尾部的整个长度。该研究结果显示，精子中存在TCTE3 mRNA和蛋白的表达；特发性弱精子症患者与正常男性相比，精子中TCTE3 mRNA和蛋白表达明显下降，提示特发性弱精子症患者精子中 TCTE3表达下降可能导致精子活力低下。TCTE3表达降低可能会引起精子鞭毛轴丝双联微管内侧轻链缺失，导致精子活力低下，最终导致不育症的发生。然而，考虑到tctex1、tctex2表达的高度相似性，也许一种tctex表达的变化可能导致其他tctexs表达的改变，因此同时检测tctexs家族成员在精子中的表达可更好地阐述其在影响精子活力方面的作用。

综上所述，TCTE3作为一个新的标志物， 其表达的降低在特发性弱精子症发病分子机制的研究中具有重大意义，但是精子中TCTE3 表达下调的机制以及与tctexs之间的相互作用有待于进一步的探索研究。

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(2013-04-03 收稿 责任编辑 李沛寰)

Expression of TCTE3 in spermatozoa of idiopathic asthenozoospermic patients

LIYushan,JIXiaofei,WANGQuanxian,YANGXianfeng,PANZhouhui,HUYaolong

HumanSpermBank,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

T-complex associated testis expressed 3;idiopathic asthenozoospermia;axonemal dynein

Aim:To explore the relationship of T-complex associated testis expressed 3(TCTE3) with idiopathic asthenozoospermia.Methods:The mRNA and protein expressions of TCTE3 in 30 cases of normal adult male and 30 cases of idiopathic asthenozoospermia semen samples were detected by using RT-PCR and Western blot. Results: The relative expression levels of TCTE3 mRNA and protein in the idiopathic asthenozoospermia group were significantly lower than those in the normal control group(t=3.038 and 2.460，P=0.005 and 0.017).Conclusion: The reduced expression of TCTE3 may play an important role in the incidence of idiopathic asthenozoospermia.

*郑州市科技攻关计划项目 2010S0828

R698.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.023