气管内滴入核仁素shRNA表达载体对脂多糖肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞活化的影响

王 艺 徐剑铖 毛 梅 李秋梅 田 静 苏 磊

肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM))是肺部炎症反应的主要始动细胞，也是脂多糖(lipopolysacharide,LPS)的主要效应细胞，其表面表达有多种模式识别受体可以识别结合LPS，启动跨膜和细胞内信号传导，引起多种炎症介质和细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的释放，从而导致过度炎症反应和急性肺损伤(acute lung injury，ALI)[1-3]。核仁素(nucleolin，由C23基因编码)是真核细胞核仁中含量最丰富的一种蛋白质，它是一种穿梭蛋白，可以自由穿梭于细胞核、细胞浆和细胞膜之间，具有多种生物学功能，参与了细胞周期的调节，并在病原微生物的感染和自身免疫系统疾病中也发挥一定的作用[4]。目前大量研究表明核仁素在单核-巨噬细胞系统膜表面广泛分布并且参与了LPS所致炎症反应[5-8]。我们前期的研究发现正常大鼠AM膜表面表达有核仁素，体外实验证实其参与了LPS的内化及对AM的激活，它可能是LPS的一种新的膜识别受体[9]。

本实验拟在体应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术，通过气管滴入的方法转染针对核仁素的shRNA表达载体，干扰大鼠AM膜核仁素的表达，观察其对LPS所致ALI大鼠的保护作用，为阐明AM膜核仁素在LPS诱导ALI中的作用及机制提供实验依据。

材料与方法

一、试剂和动物

成年清洁级SD大鼠，体质量(200±20)g，购自第三军医大学实验动物中心。重组质粒pBS-U6.C23shRNA及对照质粒pBS-U6.ControlshRNA由美国Ambion公司合成，jetPEITM转染试剂购自法国Polyplus-transfection公司，LPS(E coli O55:B5)购自美国Sigma Invitrogen公司，大鼠TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒购自晶美生物科技公司，抗鼠C23抗体、抗NF-κBp65抗体及PVDF膜购自SantaCruz公司，蛋白定量BCA法试剂盒和细胞膜、细胞核蛋白提取试剂盒均为碧云天生物技术公司产品。

二、实验动物分组

健康雄性SD大鼠40只，随机分为A组(空白对照组)，B组(ALI组)，C组(转染重组质粒pBS-U6.C23shRNA并ALI组)，D组(转染对照质粒pBS-U6.ControlshRNA并ALI组)，每组10只动物。

三、气管内滴注转染重组质粒

将100 μg的重组质粒pBS-U6.C23shRNA溶于300 μl的生理盐水中，将200 μg的jetPEITM 溶于300 μl生理盐水中，将二者混合迅速振荡混匀溶液(共600 μl)，室温下孵育20 min后抽入无菌1 ml注射器，待转染。C组大鼠经2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于鼠板上，消毒切开颈部皮肤，钝性分离出气管，将装有质粒DNA 1ml的注射器经两气管软骨环间隙穿刺进入气管，回抽无阻力并有空气则证明在气管内，将转染液体缓慢推入。推注完毕后，拔出注射器，立即将鼠板直立旋转，使气管内的液体均匀分布至两肺，最后消毒缝合切口，等待复苏。苏醒后的大鼠继续饲养待建立LPS致ALI的动物模型。同法，将D组大鼠经气管内滴入转染对照质粒pBS-U6.ControlshRNA 100 μg。

四、LPS致ALI模型建立

转染48 h后，B、C、D组大鼠经尾静脉缓慢注射LPS(E coli O55:B5)5 mg/kg，A组大鼠经尾静脉缓慢注射生理盐水，15 min注射完毕。观察大鼠自主呼吸，实验在注射LPS 4 h后结束。

五、观察指标及方法

各组动物致伤后4 h，做如下实验：①ELISA测定大鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中TNF-α及IL-6的含量：无菌条件下收集BALF，按TNF-α及IL-6 ELISA检测试剂盒说明书操作检测BALF中TNF-α及IL-6蛋白的浓度，用酶标仪在450 nm处测吸光值；②Western blot检测AM膜核仁素蛋白表达：BALF离心沉淀用膜蛋白提取试剂提取AM膜蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，后分别加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min，离心后取上清液上样进行聚丙烯凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，电转将蛋白条带转移到PVDF膜上，用含50 g/L脱脂奶粉的封闭液封闭2 h，一抗(兔抗大鼠C23多克隆抗体，稀释度1︰500)4 ℃孵育过夜，二抗(羊抗兔IgG/HRP，稀释度1︰1000)37 ℃孵育1 h，洗膜后用化学发光试剂显色；③EMSA检测NF-κB活性：提取大鼠AM核蛋白，将核提取物、生物素标记特异性探针和结合反应液等混合制成结合反应体系，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜、化学发光反应，应用Quantity One图像分析软件测定各条带积分光密度值表示核提取物中NF-KB的活性，同时进行特异性与非特异性竞争试验；④左下肺组织固定后石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察。

五、统计学方法

结 果

一、肺组织病理学观察

大鼠肺组织病理变化，见图1。A组肺泡腔结构、完整，无明显病理变化，组间无显著差异；B组肺泡结构破坏明显，部分肺泡腔变小，肺泡间隔增厚，间质增生，可见较多的炎性细胞浸润；C组肺泡结构仍有破坏，但较B组损伤有减轻，部分肺泡壁增厚，肺间质增生减轻，浸润的炎性细胞减少，与B组相比炎症有减轻；而D组与B组病理变化无明显差异。

注：A：对照组; B：LPS处理组;C：LPS+pBS-U6.C23 shRNA组;D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA组

二、AM膜核仁素蛋白表达

经LPS处理后，B组及D组的大鼠AM膜核仁素蛋白表达显著增加，与A组相比，组间有统计学意义(P<0.01)；C组大鼠AM膜核仁素蛋白表达明显下调，与B组相比，组间差异有统计学意义(P<0.01)；而D组与B组中的大鼠AM膜核仁素蛋白表达组间差异无统计意义(P>0.05)，见图2。

注：A：对照组; B：LPS处理组; C：LPS+pBS-U6.C23shRNA组;D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA组；﹡P<0.01与对照组比较；△P<0.01 与LPS组比较

三、AM中NF-κB活性变化

对照组大鼠AM中NF-κB活性较弱，经LPS处理后，各组大鼠AM中NF-κB活性显著增加，与A组相比，组间差异非常明显(P<0.01)。C组大鼠AM中NF-κB活性明显降低，与B组比较，差异显著(P<0.05)；而D组与B组比较，组间无明显差异(P>0.05)，见图3。

四、BALF中TNF-α 和IL-6的含量

经LPS诱导肺损伤后，显著增加了大鼠BALF中促炎因子TNF-α 和IL-6的表达，各组和A组相比差异显著(P<0.01)；C组大鼠BALF中TNF-α 和IL-6的含量显著降低，与B组相比差异显著(P<0.01)；而D组与B组相比，组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

注：A：对照组；B：LPS处理组；C：LPS+pBS-U6.C23shRNA组；D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA组；﹡P<0.01 与对照组比较；△P<0.05 与LPS组比较

注：A：对照组；B：LPS处理组；C：LPS+pBS-U6.C23shRNA组；D：LPS+pBS-U6.ControlshRNA组；﹡P<0.01 与对照组比较；△P<0.01 与LPS组比较

讨 论

AM是肺先天免疫系统中的前卫细胞，是接触抗原最早、机会最多的细胞，也是LPS的靶细胞。其表面多种膜受体和膜分子如CD14、Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)、β2整合素(CD11/CD18)以及甘露糖受体(mannose receptor,CD206)等均参与了LPS的识别及信号传导，但阻断这些受体并不能完全抑制炎症因子的释放和减轻肺损伤，提示还有其他膜受体存在的可能性；并且LPS还可能与某些膜受体结合并被转运入细胞内，直接激活细胞内的信号传导[10]。因此，进一步明确LPS的膜结合受体及信号传导机制，有利于阐明LPS致ALI的发病机制及寻找新的治疗靶点。

核仁素以磷酸化的形式存在于细胞膜表面，已知它在单核-巨噬细胞膜表面有表达并且具有与糖蛋白中的多糖链结合的特性[11-14]，依据这一特性同时由于LPS分子结构中含有O-侧链多糖，有学者提出单核巨噬细胞膜核仁素可能识别LPS而参与LPS所致炎症反应的假说。方立等[5]发现核仁素存在于人外周血单核细胞(THP-1)膜表面，抗核仁素抗体可以显著抑制LPS诱导的早期炎症介质TNF-α、IL-1β的表达与分泌。在内毒素血症小鼠的肺组织和RAW264.7 细胞炎症模型中，相对分子量为110×103的核仁素表达上调，相对分子量为80×103的核仁素片段表达减少，在核仁素过表达组LPS所致的IL -1β释放明显增加；而在核仁素低表达组LPS所致的IL -1β释放明显减少[6]。近来研究发现革兰氏阴性菌感染人THP-1单核细胞时伴有核仁素表达上调；LPS诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞活化时伴有核仁素裂解片段的表达下调[7-8]。我们前期的实验发现大鼠AM膜核仁素在LPS的识别和信号传导过程中发挥重要作用，但其具体的结合机制和信号传导机制尚未明确[9]。

由于AM膜核仁素分子处于LPS信号识别和转导的上游环节，如果能减少膜核仁分子表达和或抑制膜核仁分子的生物学作用，则有可能从上游环节入手来阻断信号转导途径，避免产生过度的炎症反应，从而在LPS所致的ALI发病早期开展有效的抗炎治疗。我们采用RNA干扰技术，来沉默目的基因。基于ALI的器官特异性，我们选择了气管内滴入的方法转染pBS -U6C23shRNA质粒。实验结果证实了jetPEITM体内转染shRNA的高效性和安全性，与对照组相比，BALF中AM膜核仁素蛋白表达明显下降，干扰效率达到72%同时也说明通过气道转染的方法是安全可行的。实验中我们对比分析了各组大鼠BALF中的TNF-α和IL-6的蛋白水平，发现预先给予气管内转染pBS-U6C23shRNA质粒后，BALF中的TNF-α和IL-6蛋白表达水平均明显降低，NF-κB的活性也明显下降，进一步在体内实验中证实了RNA干扰对膜核仁素介导的LPS信号传导具有明显的阻断作用。其次，我们还发现气管内滴入的方法转染pBS-U6C23shRNA质粒后，一定程度上可以改善、缓解肺的病理损伤，说明核仁素RNA干扰在一定程度上减轻了肺损伤，减轻了肺部炎症，提示AM膜核仁素在LPS诱导的大鼠ALI的发病过程中起到一定作用。RNA干扰可以通过抑制AM膜核仁素表达，减少LPS内化入AM，降低NF-κB活性，减少分泌TNF-α和IL-6炎症因子，减轻肺损伤，因此，沉默核仁素基因有望成为防治LPS所致ALI的有效手段之一。

沉默核仁素基因可通过阻断AM信号通路来减轻炎症反应，从而可能对LPS所致的ALI起到保护作用。但由于本研究以实验动物作为载体，具有一定的局限性，尚需进一步的临床实验为防治LPS所致的ALI提供更有力的实验依据。

参 考 文 献

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